白樺丹醌通過抑制PC9細胞遷移及PC9誘導的破骨細胞形成阻止肺癌骨轉移的實驗研究

儲建軍　丁建東

【摘要】 目的：研究白樺丹醌在抗人類肺腺癌細胞系PC9骨轉移中的作用。 方法：采用左心室注射穩轉熒光素酶的PC9細胞構建肺癌骨轉移動物模型，研究白樺丹醌對PC9骨轉移的抑制作用；采用SRB研究白樺丹醌對PC9的毒性作用，采用transwell遷移實驗檢測其對PC9體外遷移的抑制作用；采用PC9與Raw264.7共培養構建肺癌誘導破骨形成并用白樺丹醌處理，研究白樺丹醌對PC9誘導形成破骨細的抑制作用。結果：動物實驗顯示，心室注射PC9細胞40 d后，對照組5只裸鼠均出現明顯轉移，而用藥組雖然也出現4只裸鼠轉移，但用藥組轉移灶的光子值（2 759 200±2 670 290）顯著小于對照組（8 732 800±6 191 628）（P<0.05）。SRB顯示2 μM白樺丹醌對PC9無明顯殺傷作用，但可顯著抑制PC9的遷移能力及顯著抑制PC9誘導的破骨細胞形成，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：白樺丹醌可通過抑制PC9遷移及抑制PC9誘導的破骨細胞形成的方式抑制PC9骨轉移，顯示其作為抗肺癌骨轉移藥物的應用前景。

【關鍵詞】 肺腺癌； 白樺丹醌； 破骨細胞； 遷移； 骨轉移

肺癌是目前全世界發病率和死亡率最高的癌癥之一。美國每年大約170 000人死于肺癌，占整個癌癥死亡總數的30%[1]。與其他惡性腫瘤一樣，肺癌的轉移是造成治療失敗和患者死亡的首要原因[2]。骨是肺癌最常見的轉移部位之一，約30%～40%的進展期肺癌出現骨轉移[3]，其中大部分為溶骨性轉移。盡管近年來對于癌癥骨轉移的治療取得了一定的進步，但肺癌骨轉移的中位生存期仍徘徊在半年左右，成為醫學界亟待解決的一大難題。研制安全高效的癌癥骨轉移抑制劑是癌癥治療領域的難點和熱點。

最近的研究表明，白樺丹醌（Plumbagin）對乳腺癌骨轉移及大細胞肺癌的化療具有一定的作用[4-5]，但目前還沒有白樺丹醌用于肺腺癌骨轉移研究的相關報道。Li等[4]的研究表明，白樺丹醌在不明顯影響Raw264.7增殖的濃度下可有效抑制破骨細胞的形成和活性。鑒于此研究基礎，筆者進一步研究白樺丹醌對于肺腺癌骨轉移的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 熒光素酶（luciferase）標記的人肺腺癌細胞系PC9及小鼠巨噬細胞系Raw264.7由華東師范大學—長征醫院骨腫瘤聯合研究中心惠贈；白樺丹醌粉末、熒光素酶底物（D-luciferin）購自于美國sigma公司；培養皿購自丹麥Corning公司；Trap染色試劑盒購自美國sigma公司，重組鼠RANKL、M-CSF購自美國R&D公司；磺酰羅丹明B（suHbrhodamine B，SRB）購于美國Sigma公司；RPMI 1640及α-MEM培養基、胰蛋白酶、小牛血清購自美國Gibco公司；Boyden小室購自美國Millipore公司；其余試劑均為市售分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 SRB檢測白樺丹醌對PC9的毒性作用 將處于對數生長期的PC9細胞按5×103個/孔的密度將細胞接種到96孔板，在37 ℃，5% CO2，95% 濕度的條件下培養，使其貼壁。24 h后更換含有不同濃度白樺丹醌的培養基，每個濃度設3個復孔。48 h后加入25 μL/孔的50%三氯醋酸溶液，4 ℃固定1 h；沖洗5遍，室溫晾干；加入SRB染液，室溫染色10 min。倒掉SRB染液，用1%冰乙酸洗5遍，室溫晾干；再加入100 μL/孔10 mM 的Tris堿液，酶標儀讀取OD515（optical density，OD）值。

1.2.2 遷移實驗 將腫瘤細胞重懸于無血清的RPMI1640培養基，細胞濃度調整為5萬/200 μL， 取200 μL接種于穿梭小室的上層，在下面的小室中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基600 μL。36 h后使用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，并在顯微鏡下拍照，統計遷移的腫瘤細胞。

1.2.3 肺腺癌細胞PC9誘導破骨細胞形成實驗 將PC9與Raw264.7按照1：10的比例混合接種于48孔板（細胞總數為0.3×104），待細胞貼壁后更換含不同濃度白樺丹醌的培養基。培養基添加M-CSF及 RANKL各10 ng/mL，每3天換液。3～5 d后，經多聚甲醛固定及Trap染色，統計破骨細胞數目。Trap染色按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 肺腺癌PC9骨轉移的檢測 將處于對數生長期的PC9細胞消化、重懸于PBS，密度調整為1×105/100 μL。通過左心室注射將細胞接種于4～5周的裸鼠體內（購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司）。小鼠隨機分為DMSO組和白樺丹醌組（3 mg/kg體重），每組5只，每2天腹腔給藥一次。 30 d后檢測IVIS活體成像信號及光子值（美國Caliper Life Sciences公司），并經X線成像儀檢測骨破壞程度（美國Kodak公司）。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 白樺丹醌對PC9骨轉移的抑制作用 參照Li等[4]的研究結果，本研究實驗組小鼠給予3 mg/kg白樺丹醌，每2天給藥1次。30 d后開始拍攝IVIS活體成像跟蹤監測小鼠的骨轉移情況并用X線成像儀進行確認。研究發現白樺丹醌可明顯抑制PC9骨轉移的發生（圖1）：至左心室注射PC9細胞后的40 d，對照組（control）均出現明顯轉移；而白樺丹醌組（PL）只有4只出現轉移，且熒光信號

（2 759 200±2 670 290）明顯弱于對照組（8 732 800±6 191 628）（圖1A上、圖1B）；經X線確認，對照組小鼠脛骨發生明顯的溶骨性缺損，而白樺丹醌組的變化不明顯或者明顯弱于對照組（圖1A下）。以上結果表明，白樺丹醌可有效抑制PC9的骨轉移。大量研究表明，抑制癌細胞遷移及癌細胞誘導形成的破骨細胞形成和活性可有效治療癌癥骨轉移[6-9]，因此，筆者進一步研究白樺丹醌抑制PC9骨轉移的作用是否也與此兩種方式有關。endprint

2.2 白樺丹醌對PC9誘導形成破骨細胞的抑制作用 為了研究白樺丹醌抑制PC9骨轉移是否與抑制肺癌細胞誘導的破骨細胞形成有關，筆者采用PC9與raw264.7細胞的共培養體系進行驗證。將PC9與Raw264.7按1：10的比例進行接種，同時添加10 ng RankL、可明顯誘導形成破骨細胞（圖2A左），而Raw264.7單獨培養添加10 ng Rankl時無明顯破骨細胞形成。在此基礎上，筆者進一步研究白樺丹醌對PC9誘導形成的破骨細胞的抑制作用，Li等的研究已經證明2 μM白樺丹醌對Raw264.7的增殖無明顯影響，但明顯抑制破骨細胞的形成及活性[4]。因此，筆者也檢測2 μM白樺丹醌對PC9誘導破骨細胞形成的影響。研究也發現，2 μM白樺丹醌可明顯抑制PC9誘導的破骨細胞形成（圖2右、圖2B）。

2.3 白樺丹醌對PC9遷移能力的抑 制作用 為了進一步研究白樺丹醌抑制PC9骨轉移是否與抑制肺癌細胞的遷移有關，筆者采用transwell遷移實驗對其進行驗證。研究發現，白樺丹醌2 uM時可顯著抑制PC9的體外遷移能力（圖3）。

2.4 白樺丹醌對PC9細胞的毒性作用 為了排除白樺丹醌對PC9骨轉移的抑制作用是由白樺丹醌的毒性作用造成，筆者進一步研究2 μM白樺丹醌對PC9增殖的影響。研究發現，2 μM白樺丹醌對PC9無明顯殺傷作用（圖4），當2 μM白樺丹醌作用于PC9時約90%的腫瘤細胞存活。以上實驗說明，2 μM白樺丹醌對PC9及Raw264.7均無明顯的毒性作用，白樺丹醌對PC9遷移及其誘導形成破骨細胞的抑制不是主要通過抑制PC9增殖所引起。

3 討論

骨是肺癌最為常見的轉移部位之一，肺癌一旦發生骨轉移，常導致骨痛、高鈣血癥、病理性骨折、脊髓壓迫甚至癱瘓等并發癥，嚴重影響患者的生存質量及生存期，加速患者的死亡進程，給患者及其家庭和社會帶來沉重負擔[10-11] 。但是目前對于癌癥骨轉移的治療方案有限，主要為雙磷酸鹽和針對RankL的單克隆抗體德尼單抗（Denosumab），其中德尼單抗過于昂貴；而雙磷酸鹽雖然對破骨細胞介導的骨吸收有一定效果，但是對癌癥治療的作用存在較大爭議。鑒于此，美國腫瘤臨床學會對于尚未發現骨轉移的癌癥患者不推薦使用雙磷酸鹽進行治療[12]。因此，若能開發一種既能抗肺癌遷移又能抑制肺癌在骨中生長侵襲的藥物，將大大提高肺癌骨轉移的預防及治療效果。

白樺丹醌，是維生素K3的類似物，是白花丹（（Plumbago zeylanica）根的提取物。白花丹已經在中國傳統醫學中安全使用了幾個世紀，用于治療多種疾病，包括微生物感染和過敏反應等。大量研究表明，白樺丹醌有顯著的抗腫瘤作用，包括促進腫瘤相關的凋亡、侵襲、血管新生等[13-17]。最近的研究表明，白樺丹醌可有效抑制破骨細胞的形成及抑制乳腺癌骨轉移[4]，而在肺癌骨轉移領域還未見報道。本研究采用白樺丹醌處理人肺腺癌細胞系PC9及其骨轉移動物模型，觀察其對肺癌骨轉移的影響，并研究其作用機制，為將其進一步開發應用提供理論依據及實驗基礎。

Li等[4]的研究顯示，2 μM的白樺丹醌可明顯抑制破骨細胞的形成及骨吸收能力，而對腫瘤細胞及raw264.7細胞無明顯的毒性作用。筆者的研究也發現，2 μM的白樺丹醌對PC9細胞無明顯殺傷作用。而此濃度可有效地抑制PC9的遷移及抑制PC9與raw264.7共培養形成的破骨細胞形成；動物實驗也顯示白樺丹醌可有效抑制PC9骨轉移。

綜上所述，白樺丹醌可通過抑制肺腺癌細胞誘導形成的破骨細胞及抑制肺癌的遷移兩種方式阻止肺癌骨轉移，筆者將進一步研究其具體的分子機制。

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（收稿日期：2014-01-02） （本文編輯：陳丹云）endprint

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