高效液相色譜法同時測定人血漿中異煙肼、乙酰異煙肼和吡嗪酰胺的濃度*

張亮，錢智磊，陸磊，侯文潔，王潔

南京市胸科醫院藥學部，南京 210029

高效液相色譜法同時測定人血漿中異煙肼、乙酰異煙肼和吡嗪酰胺的濃度*

張亮，錢智磊，陸磊，侯文潔，王潔**

南京市胸科醫院藥學部，南京 210029

目的：建立高效液相色譜法同時測定人血漿中異煙肼、乙酰異煙肼和吡嗪酰胺的濃度。方法：色譜柱為Inertsil ODS-SP（4.6 mm×150 mm，5 μm），以甲醇∶0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀（三乙胺調pH 5.6）為流動相，柱溫：40℃，流速：1.0 mL·min-1，進樣體積：20 μL，檢測波長：268 nm。結果：3組分在線性范圍內與峰面積線性關系良好（r2＞0.9940），日內、日間精密度RSD＜10%，平均回收率在80%～120%。結論：本方法專屬性好，樣品處理簡單，符合生物樣品分析要求。

高效液相色譜法；異煙肼；乙酰異煙肼；吡嗪酰胺；血藥濃度

本文使用HPLC法同時測定血漿中INH、Ac-INH和PZA并進行了方法學研究。

1 儀器與試藥

LC-20AB高效液相色譜系統（檢測器為SPDM20A，日本島津）；電子分析天平（EB224，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

異煙肼對照品（批號：100578-200401，中國藥品生物制品檢定所）；吡嗪酰胺對照品（批號：100178-200403，中國藥品生物制品檢定所）；乙酰異煙肼對照品（批號：3-JES-102-4，Toronto Research Chemicals Inc.)。

甲醇為色譜純；磷酸二氫鉀、三乙胺為分析純；水為自制雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）∶0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀（B，三乙胺調pH 5.6）（梯度為1 min～10 min：A∶B為2∶98，10 min～11 min梯度變為A∶B為80∶20，11 min：A∶B為80∶20，淋洗時間共25 min）；檢測波長：268 nm；柱溫：40℃；流速：1 mL·min-1；進樣體積：20 μL。

2.2 血漿樣品處理

取血漿樣品300 μL放入2 mL離心管中，加甲醇700 μL，渦旋混合5 min，15000 r·min-1離心15 min，取上清液經0.45 μm濾膜過濾后轉移至自動進樣器小瓶中。

老徐笑：五年前，第一回見到你就感覺你特別，坐在輪椅上，比誰都愛說愛笑；我跟老伴說，也沒見女孩的媽媽跟來陪讀，可憐見的，問你，你說學校已經挺照顧你，把你安排在一樓的宿舍，還敲掉一小段臺階，修了個可供輪椅出入的坡道。“媽媽嘛，有媽媽的事，是我不要她陪的。要不然我再大一點，也不會洗床單，不會曬被子。”

2.3 方法專屬性試驗

按照本實驗方法，INH、AcINH和PZA有較好的分離，互不干擾測定，血漿中的雜質峰對樣品的測定也沒有影響。色譜圖見圖1。

圖1 INH、AcINH和PZA的色譜圖

2.4 線性關系考察

精密稱取對照品適量置于10 mL量瓶中，加入甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，配成濃度分別為INH 1000 μg·mL-1、AcINH 1000 μg·mL-1、PZA 10000 μg·mL-1的標準儲備液。分別在9份300μL的空白血漿中，加入一定量的標準儲備液，使血漿中藥物濃度為0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 μg· mL-1。按“2.2”項下方法操作，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作線性回歸，結果見表1。

表1 3組分回歸方程和線性范圍

2.5 精密度和準確度試驗

分別于300 μL的空白血漿中加入標準儲備液，精確配制成含低、中、高3種不同INH（0.5、5、25 μg·mL-1）、AcINH（0.5、5、25 μg·mL-1）、PZA（0.5、5、25 μg·mL-1）濃度的血漿樣品，按“2.2”項下方法操作，測定日內（5次）和日間（5 d）精密度，RSD均小于10%。見表2。

2.6 穩定性考察

于300 μL的空白血漿中加入標準儲備液，精確配制成含INH（0.5、5、25 μg·mL-1）、AcINH（0.5、5，25 μg·mL-1）、PZA（0.5、5、25 μg·mL-1）濃度的血漿樣品，分別在室溫下放置0、2、4、8、12 h后按“2.2”項下方法操作，測定樣品峰面積和內標峰面積的比值。由表3可見，測定樣品基本保持穩定。

表2 精密度及回收率試驗（n=5）

表3 穩定性試驗結果（n=5）

2.7 回收率試驗

分別于300 μL的空白血漿中加入標準儲備液，精確配制成含低、中、高3種不同INH（0.5、5、25 μg·mL-1）、AcINH（0.5、5、25 μg·mL-1）、PZA（0.5、5、25 μg·mL-1）濃度的血漿樣品，按“2.2”項下方法操作，每個濃度測5次，計算平均回收率和RSD。見表2。

3 血藥濃度檢測的應用

本方法成功用于30例口服INH和PZA患者的血藥濃度檢測。服藥方法為INH 0.3 g每日1次，早飯后半小時頓服；PZA 0.5 g每日2次早晚飯后半小時服。早飯后2.5小時采集血樣，并于3小時內分析完畢，不能及時測試的保存在-40℃冰箱內。從測試結果看，患者血漿中的藥物濃度差異較大。INH血藥濃度在0.37～5.8 μg·mL-1（1.8±0.59 μg·mL-1），AcINH血藥濃度在0.34～3.1 μg·mL-1（1.63±0.52 μg·mL-1），PZA血藥濃度在2.58～14.18 μg·mL-1（6.98±2.86 μg·mL-1）。

4 討論

目前已有多種高效液相色譜（HPLC）的方法同時測定血漿中的多組分抗結核藥，但普遍使用了離子對試劑[3-4]。本課題組在反復試驗后發現在反相色譜中使用離子對試劑有如下幾點不足：（1）需要較長的柱平衡時間；（2）實驗重現性較差；（3）離子對試劑對色譜柱的損害較大；（4）使用成本過高。這導致了此種方法事實上很難用于臨床大量血漿樣本的常規檢測。所以，在嘗試了多種緩沖對后最終選擇了磷酸緩沖鹽。雖然在分離度方面略微低于離子對試劑，但依然能夠達到專屬性試驗的要求，很方便地用于臨床大量血漿樣本的檢測。

液相-質譜聯用（LC-MS）擁有超高的選擇性和靈敏度可以同時分析血漿中的多種藥物[5]，但使用成本過高在醫院尚未普及。因此，使用HPLC技術對多種抗結核藥及其代謝物進行血藥濃度監測依然是最常用和最經濟的方法，在本實驗中，INH、Ac-INH和PZA由于極性較強，導致在色譜柱上保留時間過短，且易受血漿雜質的影響。為了獲得良好的分離度和峰形，本實驗曾嘗試使用苯基柱和氰基柱，雖可延長保留時間但峰形欠佳。曾嘗試以pH=6的磷酸二氫鉀為緩沖對，在高極性流動相的洗脫下可以實現樣品的分離，但此時AcINH拖尾較嚴重，導致和INH的分離度達不到1.5。最終采用pH=5.6的磷酸緩沖時，AcINH拖尾不明顯，與INH的分離度能夠達到1.5。

在血漿樣品處理方法中，曾嘗試用乙酸乙酯萃取，但由于這3種組分的極性過大而棄用。還嘗試將沉淀蛋白后的上清液吹干用流動相復溶，但需額外加入抗氧化劑，影響了多組分藥物的穩定性。最終使用甲醇沉淀蛋白后直接取上清液迅速進樣。該法無需吹干復溶，因此既避免樣品氧化，又簡化了操作步驟，便于臨床大批量樣本的檢測。

本實驗方法簡單、準確、成本較低，保留時間較為合適。如果使用250 mm的C18柱還可以延長保留時間，增加分離度。整套方法回收率高于80%，日間和日內RSD小于10%，完全符合生物樣品分析要求，可以用于臨床藥物檢測及藥物動力學研究。本方法可作為抗結核藥物測定的參考。

[1] World Health Organization.Treatment of Tuberculosis: Guideline for National Programmers[EB/OL].3rd ed., 2003,Geneva.

[2] 郎美琦，蔣利，黃佳盛.抗結核病藥物治療綜述[J].臨床肺科雜志，2010，15（8）：1153-4.

[3] Khuhawar MY,Rind FMA.Liquid chromatographic determinationofisoniazid,pyrazinamideandrifampicin from pharmaceutical preparations and blood[J].Chromatogr B,2002,766(2):357-63.

[4] Zhou ZF,Chen LY,Liu P,et al.Simultaneous determination of isoniazid,pyrazinamide,rifampicin and acetylisoniazid in human plasma by high-performance liquid chromatography[J].Anal Sci,2010,26(11):1133-8.

[5] Gong Z,Basir Y,Chu D,et al.A rapid and robust liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for simultaneous analysis of anti-tuberculosis drugs--ethambutolandpyrazinamideinhumanplasma[J].Chromatogr B,2009,877(16):1698-703.

DeterminationofIsoniazid,AcetylisoniazidandPyrazinamideinHuman Plasma by HPLC*

ZHANG Liang,QIAN Zhi-lei,LU Lei,HOU Wen-jie,WANG Jie**
Department of Pharmacy,Nanjing Chest Hospital,Nanjing,210029

Objective：To determine the concentrations of isoniazid,acetylisoniazid and pyrazinamide in human plasma by RP-HPLC.Methods：The HPLC method was carried out on an Inertsil ODS-SP(4.6× 150 mm,5 μm)column with 0.05 mol·L-1KH2PO4(adjusting PH to 6.0 with triethylamine)-methanol as mobile phase.The column temperature was 40℃,the flow rate was 1.0 mL·min-1and the detection wavelength was 268 nm.Results：All calibration curves had good linearity(r2＞0.99)within their tested ranges. The intra-and inter-day precision was within 10%,the extraction recovery was between 80%and 120%.Conclusion：The method is sensitive,simple and rapid.It is suitable for analyzing the drugs in biological samples.

HPLC;Isoniazid;Acetylisoniazid;Pyrazinamide;Plasma concentration

R969.1

A

1673-7806（2014）02-112-03

南京市科委藥學基金（常州四藥臨床藥學研究基金），編號：2013YX015；南京市醫學科技發展重點項目（編號：ZKX13041）

張亮，男，藥師 E-mail:zhshhine310@163.com

**通訊作者 王潔，女，主任藥師 E-mail:13905165431@163.com

2013-10-28

2013-12-10