吡非尼酮對百草枯誘導的大鼠急性肺損傷保護作用研究*

韓楓，凌心

徐州市腫瘤醫院藥劑科，徐州 221005

吡非尼酮對百草枯誘導的大鼠急性肺損傷保護作用研究*

韓楓，凌心

徐州市腫瘤醫院藥劑科，徐州 221005

目的：研究吡非尼酮（pirfenidone，PF）對百草枯（paraquat，PQ）誘導的大鼠急性肺損傷的保護作用及機制。方法：30只雄性成年SD大鼠隨機分為對照組、PQ組、PF治療低、中、高組，采用腹腔注射20%PQ溶液誘導大鼠成急性PQ中毒模型。測定各組大鼠肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）以及炎癥因子白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量變化，同時以蛋白免疫印跡法測定轉化生長因子（TGF-β）、結締組織生長因子（CTGF）、smad3蛋白表達。HE染色觀察大鼠肺組織病理改變。結果：與對照組大鼠相比，PQ組大鼠肺組織氧化應激和炎癥反應水平明顯升高，而給予PF可明顯抑制中毒大鼠肺組織氧化應激和炎癥反應。蛋白免疫印跡結果顯示，中毒大鼠肺組織中TGF-β、CTGF、smad3蛋白表達顯著升高，光鏡觀察顯示中毒大鼠肺組織大量肺泡萎縮，部分過度膨脹，組織炎性浸潤和纖維化明顯。給予PF治療后，大鼠肺組織TGF-β、CTGF和smad3蛋白表達以及組織損傷和纖維化顯著降低。結論：PF可以減輕百草枯中毒大鼠肺組織損傷，其治療作用可能與其抗炎、抗氧化、抑制TGF-β、CTGF和smad3表達有關。

吡非尼酮；百草枯；氧化應激；炎癥反應；轉化生長因子；結締組織生長因子

百草枯（paraquat，PQ，見圖1）是一種有機雜環類非選擇性觸殺型、滅生性除草劑，以其除草效果好、環保等優點而得到廣泛應用，然而使用操作不當或口服均可造成中毒[1]。PQ對皮膚、肝臟、肺臟、腎臟等器官均有不同程度的損傷，其中以肺臟毒性尤為突出，主要表現為急性肺泡炎和肺纖維化[2]，但其致肺損傷和纖維化的作用機制目前尚未闡明，且無有效拮抗藥物，患者常死于多臟器功能衰竭或呼吸衰竭，預后較差[3-4]。

吡非尼酮（pirfenidone，PF，見圖1）是一種口服易吸收的小分子藥物，臨床可用于特發性肺纖維化（IPF）的治療[5]。研究表明，PF可抑制多種細胞因子的產生，包括白介素6（IL-6）、轉化生長因子（TGF-β）等[6]，具有較好地抗肺纖維化作用?；谄漭^好的療效，其藥物作用機制已成為國內外學者研究的熱點[7-8]，但其肺保護作用機制尚未完全明確。本實驗通過建立PQ誘導大鼠急性肺損傷模型，研究PF對大鼠急性肺損傷及纖維化的治療作用及相關機制。

圖1 百草枯和吡非尼酮結構式

1 材料和方法

1.1 主要儀器及設備

UV-754紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；TGL-16G臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；SSH-2型電熱恒溫水?。ㄉ虾＞芸茖W儀器有限公司）；IX71光學顯微鏡（日本奧林巴斯光學工業株式會社）。

1.2 藥品和試劑

PF（純度99%，南京榮世醫藥科技有限公司）；PQ，山東三元工貿有限公司；大鼠白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA試劑盒（上海西塘生物有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；轉化生長因子（TGF-β）、結締組織生長因子（CTGF）、smad3多克隆一抗（美國BioVision公司）。

1.3 實驗動物

雄性成年SD大鼠30只，體重280～310 g，由徐州醫學院動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 大鼠急性肺損傷模型的制備

將SD大鼠隨機分為5組，每組6只，分別為正常對照組、PQ組、PF治療低、中、高劑量組。自由飲食一周后，PQ組和PF組大鼠給予一次性腹腔注射PQ 25 mg·kg-1；對照組給予腹腔注射等量的生理鹽水。腹腔注射1 h后，灌胃給予PF治療，PF低、中、高組劑量分別為10 mg·kg-1、20 mg·kg-1和40 mg· kg-1（PF溶于0.5%的CMC-Na中）；對照組大鼠灌胃給予等量CMC-Na溶液。

2.2 樣本采集

連續給藥3 d，將各組大鼠麻醉處死，取大鼠左肺置于體積重量為4%多聚甲醛固定液中固定，同時取大鼠右肺立刻于-80℃保存，進行后續生化指標測定。

2.3 HE染色

將固定好的大鼠右肺組織進行常規石蠟包埋，連續性49 μm切片，后進行HE染色實驗。

2.4 Western blot測定蛋白表達

稱取肺組織充分研磨后，按每克組織加入0.5 mL預冷的勻漿緩沖液[Tris緩沖液（TBS）∶苯甲基磺酰氟（PMSF）=20∶11]，組織勻漿器12000 r·min-1冰浴勻漿30 s，14000 g 4℃離心15 min，取上清液，BCA蛋白質定量試劑盒測定蛋白濃度。取各組胞漿蛋白，加入等體積10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）樣品緩沖液，沸水浴10 min，自然冷卻后上樣行垂直凝膠電泳。水浴電轉移法將目的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，免疫組化染色marker，鑒定轉移效果。5%BSA溶液封閉1 h，室溫振蕩孵育，TBST液洗膜，分別加入兔抗大鼠TGF-β、CTGF和smad3一抗（1∶1000），4℃孵育過夜，TBST液洗膜3次，每次3 min。然后加入二抗（1∶1000）孵育2 h?；厥斩?，TBST液洗膜3次，每次3 min，加顯色劑（NBT/BCIP顯色試劑盒），隨時觀察，達到要求后流水洗滌終止反應，所得條帶經圖像處理儀進行激光掃描，Image J軟件定量分子。

2.5 生化指標測定

大鼠右肺組織勻漿后，3000 r·min-1離心10 min，取上清液，測定SOD、MDA、IL-6和TNF-α的水平，嚴格按照試劑盒規定的方法比色測定吸光度，按公式換算成SOD的活性以及MDA、IL-6和 TNF-α的濃度。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 PF對PQ損傷大鼠肺組織SOD活性和MDA含量的影響

表1結果顯示，與對照組比較，PQ組肺組織SOD活性顯著降低（P<0.001），MDA含量顯著升高（P<0.001）；與PQ組比較，PF治療中、高劑量組大鼠肺組織SOD活性升高（P<0.05），而MDA含量顯著降低（P<0.05）。

表1 PF對PQ致大鼠肺組織損傷的SOD活性和MDA含量的影響（±s，n=6）

表1 PF對PQ致大鼠肺組織損傷的SOD活性和MDA含量的影響（±s，n=6）

與對照組比較：***P<0.001，**P<0.01；與PQ組比較：#P<0.05

組別SOD（kU·g-1）MDA（mmol·g-1）對照組206.11±7.2121.902±0.123PQ組110.45±6.220***2.913±0.278**PF低劑量組125.32±5.7452.722±0.265PF中劑量組142.55±5.344#2.486±0.188#PF高劑量組182.21±4.430#2.231±0.284#

3.2 PF對PQ損傷大鼠肺組織IL-6和TNF-α含量的影響

表2結果顯示，與對照組比較，PQ組大鼠肺組織IL-6和TNF-α含量顯著升高（P<0.001）；與PQ組比較，PF治療中、高劑量組大鼠肺組織IL-6和TNF-α含量降低（P<0.05或P<0.01）。

表2 PF對PQ致大鼠肺組織損傷的IL-6和TNF-α含量的影響（±s，n=6）

表2 PF對PQ致大鼠肺組織損傷的IL-6和TNF-α含量的影響（±s，n=6）

與對照組比較：***P<0.001；與PQ組比較：#P<0.05；##P<0.01

組別IL-6（pg·mL-1）TNF-α（pg·mL-1）對照組86.94±6.6774.20±12.65PQ組658.76±4.92***437.90±6.59***PF低劑量組594.82±5.77380.70±7.33PF中劑量組420.11±6.44#260.29±10.35#PF高劑量組384.54±2.89##172.13±15.82##

3.3 PF對PQ損傷大鼠肺組織TGF-β、CTGF和smad3蛋白表達的影響

免疫印跡實驗結果顯示（見圖2和表3），PQ中毒大鼠肺組織中TGF-β的蛋白表達明顯升高（***P< 0.001），給予PF治療后與PQ組大鼠相比，其表達顯著降低（##P<0.01）；同時，染毒大鼠肺組織中CTGF蛋白表達顯著升高（**P<0.01），給予PF治療后與PQ組大鼠相比，其表達顯著降低（#P<0.05）；smad3蛋白表達在PQ中毒大鼠的肺組織中明顯升高（**P< 0.01），給予PF治療后與PQ組大鼠相比，其表達顯著降低（#P<0.05）。

圖2 PF對PQ致大鼠肺組織損傷的TGF-β、CTGF和smad3蛋白表達的影響（±s，n=3）

3.4 HE染色

對照組肺泡結構清晰，肺泡壁薄，肺泡間隔無增寬及充血，無炎性細胞浸潤及出血現象（圖3-A）；PQ組大鼠肺組織成纖維細胞大量增殖，肺充血、肺水腫及炎性細胞浸潤病變嚴重處見纖維瘢痕樣組織，肺泡萎陷或消失（圖3-B）；給予PF治療后肺組織損傷情況明顯降低（圖3-E）。

表3 TGF-β、CTGF和smad3蛋白表達灰度值比較

4 討論

多項研究表明[2，9]，PQ對染毒后機體內部氧化應激和炎癥反應水平升高，過量的氧自由基和促炎因子具有廣泛的致病作用，可引起細胞、組織和機體的損傷，在肺部炎癥、肺纖維化的進程中具有重要作用。

圖3 PF對肺組織的保護作用

有文獻報道[10]，CTGF作為即刻早期基因編碼的蛋白，具有明顯的絲裂原性和趨化性，可調控基質成分的產生和積聚，促進成纖維細胞趨化和分裂，同時CTGF mRNA變化規律與TGF-β非常類似，且TGF-β在PQ中毒動物肺組織纖維化過程中起關鍵作用，并進一步證實CTGF作為TGF-β的下游效應分子介導了其纖維化的進程。研究顯示[11]，smad蛋白家族在肺部病變及后期纖維化過程中起重要作用，可調控TGF-β在肺纖維化過程中的表達。實驗結果發現，PQ中毒大鼠肺組織氧化應激及炎癥水平顯著升高，TGF-β、CTGF及smad3的蛋白表達水平明顯增加，這與前期文獻報道相一致[10-11]。

本實驗發現，PF可明顯降低PQ中毒大鼠肺組織中氧化應激和炎癥反應水平，顯示了PF在治療肺組織纖維化過程中具有較好的抗炎、抗氧化作用；組織形態學觀察也發現，PF可顯著降低PQ中毒導致的肺部感染及組織纖維化，維持肺組織正常生理功能；同時研究發現，PF可顯著抑制大鼠肺組織中TGF-β、CTGF及smad3的蛋白表達的上調。這提示，PF對PQ中毒大鼠肺組織氧化應激和炎癥損傷均具有保護作用，且抑制了肺組織的纖維化，其保護作用與抑制TGF-β、CTGF及smad3的表達上調有關。

綜上所述，PF對PQ誘導的大鼠急性肺損傷具有顯著的保護作用，其作用機制可能與減輕肺組織自由基及炎癥反應，抑制TGF-β、CTGF及smad3的表達上調有關。

[1] Serra A,Domingos F,Prata MM.Paraquat intoxication [J].Acta Med Port,2003,16(1):25-32.

[2] Dinis-Oliveira RJ,Duarte JA,Sánchez-Navarro A,et al.Paraquat poisonings:mechanisms of lung toxicity, clinical features,and treatment[J].Crit Rev Toxicol, 2008,38(1):13-71.

[3] BertoloteJM,FleischmannA,EddlestonM,etal. Deaths from pesticide poisoning:a global response[J].Br J Psychiatry,2006,189:201-3.

[4] Sittipunt C.Paraquat poisoning[J].Respir Care,2005, 50(3):383-5.

[5] Raghu G,Johnson WC,Lockhart D,et al.Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis with a new antifibrotic agent,pirfenidone:results of a prospective,open-label PhaseⅡstudy[J].Am J Respir Crit Care Med,1999, 159(4 Pt 1):1061-9.

[6] Spond J,Case N,Chapman RW,et al.Inhibition of experimentalacutepulmonaryinflammationbypirfenidone[J].Pulm Pharmacol Ther,2003,16(4):207-14.

[7] Azuma A,Nukiwa T,Tsuboi E,et al.Double-blind, placebo-controlled trial of pirfenidone in patients with idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J Respir Crit Care Med,2005,171(9):1040-7.

[8] 李軍，偉沈秀，微孫未，等.吡非尼酮抗百草枯中毒小鼠肺纖維化的研究[J].中華勞動衛生職業病雜志，2012，29（2）：87-93.

[9] 黃敏，張平，常秀麗，等.核因子-κB及細胞因子在百草枯致大鼠肺損傷中的動態變化[J].中華勞動衛生職業病雜志，2009，27（8）：463-7.

[10] Ihn H.Pathogenesis of fibrosis:role of TGF-beta and CTGF[J].Curr Opin Rheumatol,2002,14(6):681-5.

[11] Leivonen SK,H?kkinen L,Liu D,et al.Smad3 and extracellular signal-regulated kinase 1/2 coordinately mediate transforming growth factor-beta-induced expression of connective tissue growth factor in human fibroblasts[J].J Invest Dermatol,2005,124(6):1162-9.

Protective Effects of Pirfenidone against Paraquat-Induced Lung Damage in Rats*

HAN Feng,LING Xin
Pharmacy Department,Xuzhou Cancer Hospital,Xuzhou 221005

Objective：To study the protective effect of Pirfenidone(PF)against Paraquat(PQ)-induced lung damage in rats and its underlying mechanisms.Methods：Thirty rats were randomly divided into five groups:control group,PQ group,PF low-,middle-and high-dose treatment groups.The activties of superoxide dismutase(SOD),the contents of malondialdehyde(MDA),IL-6 and TNF-α in the lung tissues were examined.Also,the expression of TGF-β,CTGF and smad3 in lung tissues w measured by Western-blotting.The lung coefficient was calculated and pathological changes of lung tissues were observed by HE staining.Results：Compared with the control group rats,the levels of oxidative stress and inflammation were increased in the lung tissues of PQ group rats,while the PF group rats exhibited significant decrease in oxidative stress and inflammation.The expression of TGF-β,CTGF and smad3 were increased in PQ group rats.The sections showed that the lung tissue damage was obvious in PQ group rats with alveolar atrophy,overinflation,inflammatory cell infiltration and pulmonary fibrosis.However,the administration of PF significantly decreased the damage.Conclusion：The results indicated that PF had a protective effect against PQ-induced lung damage in rats.It is considered that this protective effect may be related to its free radical scavenging activity,inhibition of inflammation and inhibition of the expression of TGF-β,CTGF and smad3.

Pirfenidone;Paraquat;Oxidative stress;Inflammatory reaction;Transforming growth factor; Connective tissue growth factor

R963

A

1673-7806（2014）02-101-04

徐州市科技計劃項目（編號：XZZDY1204）

韓楓，副主任藥師、藥劑科主任

E-mail:hanfeng1966@126.com

2013-12-16

2013-12-26