腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶研究進(jìn)展

摘要：碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣、抗菌活性最強(qiáng)的非典型β內(nèi)酰胺類抗生素， 因其對(duì)β內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定以及毒性低等特點(diǎn)， 已經(jīng)成為治療多重耐藥菌感染最主要的抗菌藥物之一，尤其適用于治療由產(chǎn)超光譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和\\或AmpC酶細(xì)菌所引起的嚴(yán)重感染。既往臨床實(shí)驗(yàn)室分離的耐碳青霉烯類抗生素菌株多為假單胞菌和不動(dòng)桿菌等非發(fā)酵菌。但隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類抗生素的泛耐藥腸桿菌科細(xì)菌的出現(xiàn)也越來越多。

關(guān)鍵詞：腸桿菌科細(xì)菌；碳青霉烯酶；耐藥機(jī)制；改良Hodge試驗(yàn)；PCR；同源性

由于腸桿菌科細(xì)菌是臨床上重要的醫(yī)院感染菌之一，對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥的泛耐藥腸桿菌科細(xì)菌的流行給臨床抗感染治療帶來了極大困難。引起腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類的耐藥機(jī)制主要有高產(chǎn)AmpC酶合并膜孔蛋白缺失、產(chǎn)生了水解碳青霉烯類藥物的碳青霉烯酶、青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的改變、主動(dòng)外排系統(tǒng)的活躍。其中碳青霉烯酶的產(chǎn)生是泛耐藥菌對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因。碳青霉烯酶是能夠明顯水解碳青霉烯類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶，現(xiàn)階段，已知的碳青霉烯酶主要包括以下四種，即Ambler分子分類A-D類。其中A、D類均屬于絲氨酸酶，屬于Bush分群中的第2f和2d亞組，B類主要由金屬酶過程，屬于bush分群中的第3a組。在腸桿菌科細(xì)菌中的碳青霉烯酶主要是A類酶和B類酶， 到目前為止，依據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室耐藥菌株的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道，以KPC酶最為多見，在我國(guó)，以上海、浙江等地發(fā)現(xiàn)較早、較多，并且出現(xiàn)了發(fā)生局部性的流行的趨勢(shì)。D類酶（OXA），在腸桿菌科細(xì)菌中極為少見，主要由不動(dòng)桿菌屬中檢出。碳青霉烯酶編碼基因的具有較高的應(yīng)用價(jià)值，它不僅能夠確定對(duì)基因元件中的移動(dòng)質(zhì)粒進(jìn)行固定，發(fā)揮其在菌種的傳播作用，還能夠在染色體的輔助下， 控制細(xì)菌間的傳播[1，8]。

1碳青霉烯酶的分類

1.1 A類碳青霉烯酶A類碳青霉烯酶為絲氨酸酶，其中含有絲氨酸結(jié)構(gòu)，屬于Bush分群中的第2f亞組，這類酶都是青霉素酶，他們對(duì)亞胺培南的水解活性進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)他明顯強(qiáng)于美羅培南，且還能促使青霉素類、碳青霉烯類等藥物產(chǎn)生耐藥性作用，而對(duì)第3代頭孢菌素通常敏感。他唑巴坦、克拉維酸能夠降低此類的活性，但不被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制。不水解第3代頭孢菌素。其中由質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC酶易于在不同菌種中傳播，已成為腸桿菌科細(xì)菌耐碳青霉烯類抗生素的主要原因之一。

自2001年在美國(guó)北卡羅來納州肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導(dǎo)的碳青霉烯酶KPC-l[1]，2004年紐約州質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC-3肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染之后[2]。KPC類碳青霉烯酶在全球的檢出率逐年升高，美國(guó)的紐約州和新澤西州曾一度出現(xiàn)產(chǎn)KPC類碳青霉烯酶耐藥菌株的流行[3，4]。2004年浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院首次在臨床分離到了產(chǎn)KPC-2酶的肺炎克雷伯菌之后[5]，在我國(guó)上海、浙江等地也曾報(bào)道了KPC類碳青霉烯酶?jìng)€(gè)別亞型的局部流行。KPC類碳青霉烯酶主要為質(zhì)粒介導(dǎo)，頭孢菌素類、碳青霉烯類以及氨曲南等抗生素會(huì)出現(xiàn)水解作用，且克拉維酸會(huì)明顯降低KPC酶的活性[1]。相關(guān)研究顯示，在肺炎克雷伯菌中并未檢測(cè)出KPC酶的存在，但是在腸桿菌科中其他菌種中均可檢測(cè)出不同數(shù)量的KPC酶的各種亞型，包括: 肺炎克雷伯菌的KPC-2[6]、KPC-3（質(zhì)粒介導(dǎo)）、肺炎克雷伯菌GES-4（Ⅰ類整合子介導(dǎo)）[7]、陰溝腸桿菌NMC-A[8]和IMI-1[9]、粘質(zhì)沙雷菌SME-1、SME-2、SME-3[10]、大腸埃希菌GES-3等。目前國(guó)內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)10種KPC亞型[1，2，6]（KPC-1～KPC10），其中KPC-2檢出率最高。

1.2 B類碳青霉烯酶B類碳青霉烯酶為金屬酶，屬于Bush分群中的第3a組。其活性位點(diǎn)有Zn2+，其催化活性依賴Zn2+，因此又稱為金屬β一內(nèi)酰瞎酶。其水解底物包括青霉素婁、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素，對(duì)安曲南類則不會(huì)產(chǎn)生水解作用，表現(xiàn)為產(chǎn)酶菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物的廣泛耐藥。受到EDTA等金屬螯合劑的影響，加入Zn2+后能重新促使其發(fā)展，此時(shí)受他唑巴坦、舒巴坦的影響較小，相反受大多數(shù)由整合子等對(duì)其的影響會(huì)明顯增大[11]。近年來，在腸桿菌科細(xì)菌，如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等菌種中也有發(fā)現(xiàn)。

1.3 D類碳青霉烯酶D類碳青霉烯酶主要流行于不動(dòng)桿菌屬中，其在不動(dòng)桿菌屬中的亞型也已多達(dá)60多種。但是D 類碳青霉烯酶在腸桿菌科細(xì)菌中卻極少被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，目前在腸桿菌科中發(fā)現(xiàn)的D類碳青霉烯酶為來自肺炎克雷伯菌的OXA-48[10]，其對(duì)亞胺培南有較高的水解活性，與其他OXA類碳青霉烯酶的同源性僅為46%。

2碳青霉烯酶的檢測(cè)方法

臨床試驗(yàn)室常用的檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌的篩選方法有改良Hodge試驗(yàn)（MHT）、金屬酶的EDTA檢測(cè)方法，這兩種檢測(cè)方法有簡(jiǎn)便、易操作、易判讀結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)。依據(jù)2009年版CLSI建議，對(duì)MIC增高或紙片法抑菌圈縮小的碳青霉烯類抗生素敏感腸桿菌科細(xì)菌，采用改良Hodge試驗(yàn)（MHT）檢測(cè)碳青霉烯酶，這一檢測(cè)方式的敏感度和特異度均≥90%。改良Hodge試驗(yàn)（MHT）檢測(cè)方法為：在無菌生理鹽水中準(zhǔn)備0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度的大腸埃希菌ATCC25922（指示菌），用無菌生理鹽水稀釋10倍，按常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)度將該細(xì)菌接種至直徑為90mm的MH平板，在常溫下放置5min左右，并將美羅培南藥敏紙片（10ug）置入平板中心位置。于平板上取20mm的縱向切口，并在無菌接種環(huán)的輔助下提取血板中的待測(cè)菌，并接種中介的菌株。于35℃恒溫下孵育20h，并對(duì)細(xì)菌接種情況進(jìn)行觀察，若劃線與抑菌圈交叉位置的細(xì)菌呈失狀增強(qiáng)生長(zhǎng)（典型為蘋果蒂樣生長(zhǎng)）則提示檢查結(jié)果為陽(yáng)性，否則為陰性。有文獻(xiàn)報(bào)道，用厄他培南作為實(shí)驗(yàn)底物時(shí)改良Hodge試驗(yàn)（MHT）的敏感性大于90％；用亞胺培南和美羅培南作為實(shí)驗(yàn)底物，其敏感性均較低，但亞胺培南和美羅培南作為實(shí)驗(yàn)底物時(shí)的特異性比厄他培南高[19]。由于不同種類碳青霉烯酶對(duì)藥物的水解作用有所差異，所以針對(duì)不同種類碳青霉烯酶的檢測(cè)也有不同的側(cè)重點(diǎn)。例如：KPC酶對(duì)超廣譜頭孢菌素有水解作用，因此對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟等頭孢類抗生素耐藥的菌株應(yīng)注意檢測(cè)KPC酶；改良Hodge試驗(yàn)（MHT）所檢測(cè)的菌株為底表達(dá)金屬酶菌株時(shí)，靈敏度會(huì)降低，會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此時(shí)，可采用Lee等的Hodge試驗(yàn)（MHT）改進(jìn)方法[16]，即在藥敏紙片上添加10ul50mmol/L的ZnSO4或在MH平板中加入ZnSO4使最終濃度達(dá)到70ug/ml，由于Zn2+存在可以提高金屬酶的活性，此時(shí)改良Hodge試驗(yàn)（MHT）的敏感性和特異性均＞95。

金屬酶的檢測(cè)，Lee等報(bào)道指出，抑制劑增效實(shí)驗(yàn)是行金屬酶檢測(cè)的有效方式之一[6]。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作期間可先將0.5mmol/LEDTA鈉鹽溶液注入亞胺培南紙片（每片中加入EDTA約為750ug），并對(duì)其紙片進(jìn)行分析，比對(duì)加入EDTA情況對(duì)抑菌圈的影響，并根據(jù)其檢查結(jié)果來判斷待測(cè)菌株是否產(chǎn)生金屬酶，如果加EDTA后抑菌圈直徑增大7mm及以上時(shí)判定為產(chǎn)金屬酶。

3產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌感染的治療

臨床研究表明，產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌的耐藥性具有復(fù)雜性的特點(diǎn)，且該菌株還會(huì)產(chǎn)生AmpC酶、ESBLs，并與其他耐藥機(jī)制相互影響，如外膜通透性增加、藥物作用位點(diǎn)改變、主動(dòng)外排系統(tǒng)的活躍等，使得臨床抗菌藥物的選擇更加困難。目前，當(dāng)人們感染該類細(xì)菌時(shí)，臨床并無治療該感染的特效藥物，用藥治療期間，往往先對(duì)患者的細(xì)菌耐藥性進(jìn)行分析，再確定治療方案。必要時(shí)采用抗生素的聯(lián)合應(yīng)用。去除感染危險(xiǎn)因素，盡量減少對(duì)患者的侵襲性操作。及時(shí)撥出導(dǎo)管、引流管等。

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編輯/申磊