BRAF基因與甲狀腺乳頭狀癌的相關性研究

摘要：目的 探究BRAF基因及其突變與甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)患者相關參數之間的關系。方法 應用免疫組化、PCR及基因測序技術對92例PTC患者，10例非PTC甲狀腺惡性腫瘤患者、59例結節性甲狀腺腫患者的新鮮標本進行BRAF蛋白表達情況、BRAF基因突變情況進行檢測。分析BRAF基因突變與患者年齡、性別、腫瘤直徑、有無頸淋巴結轉移、有無包膜、超聲征象等臨床病理學特征的關系。結果 92例PTC中30例檢出BRAF突變基因，而在對照組中未發現相應突變。BRAF基因突變與PTC甲狀腺腫瘤直徑相關性顯著，與性別、發病年齡、有無淋巴結轉移等無關。結論 BRAF基因突變與腫瘤直徑大小相關性顯著，突變可能影響PTC患者遠期預后。

關鍵詞：甲狀腺乳頭狀癌；BRAF基因突變預后

甲狀腺癌是最常見的內分泌腺惡性腫瘤，并且其近年的發病率呈現上升趨勢，無論是全球范圍還是在國內[1]，正逐漸引起研究者的重視。根據腫瘤切除術后的病理結果，我們可以將其分為4個類型：乳頭狀腺癌、濾泡癌、髓樣癌、未分化癌。其中以甲狀腺乳頭狀癌( papillarythyroidcarcinoma，PTC) 的發病率最高，占所有甲狀腺惡性腫瘤的80%[2]。鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體基因（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1， BRAF），位于7q23染色體，是RAF基因家族的成員之一。其編碼一個由783個氨基酸組成的蛋白，是一種特異性絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞通路RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK中，起到激活MEK/ERK的重要作用，控制細胞的增殖、分化、凋亡等進程[3]。BRAF基因外顯子15如果出現單核苷酸突變（T1799A），則其相應的產物蛋白中，谷氨酸取代對應的纈氨酸（V600E），使蛋白成為活化蛋白激酶，激活下游有絲分裂信號，形成腫瘤[4]。經過近幾年的研究，人們發現PTC中存在高頻率的BRAF突變，并且這種突變與PTC的病因、臨床表現、腫瘤細胞生物學行為、病理診斷、治療策略的選擇、近遠期預后等方面都具有明顯的相關性[5]。本文對本院今年來的PTC患者進行BRAF基因突變檢測，并就上述問題進行分析研究，以期對臨床治療具有指導意義。

1資料與方法

1.1一般資料實驗組：選取2011年1月~2013年6月在本院臨床考慮為甲狀腺乳頭狀癌，且行手術切除，并經病理科確診患者92例。見表1。對照組1：選取2011年1月~2013年6月就診于本院的患者，具體為7例濾泡癌、2例髓樣癌、1例未分化癌。對照組2：同時期于本院診斷為結節性甲狀腺腫的患者59例。兩組對照組的性別構成、年齡構成與實驗組無統計學差異。

以上患者診斷皆由本院基本外科甲狀腺組教授予臨床診斷，由本院病理科教授按WHO標準進行病理診斷。

1.2標本處理手術切除腫瘤組織后30min內，由病理科醫生從標本腫瘤部位切取腫瘤組織（正常組的標本取自結節性甲狀腺腫患者切除腫物周邊的正常組織），取大部組織進行石蠟包埋切片，完成病理診斷、免疫組化檢測，取部分組織（約0.5×0.5×0.5cm）用于突變基因檢測（詳見后文），剩余組織用液氮封存于標本管中。

1.3試劑實驗采用鼠抗人單克隆抗體（克隆號：EPl52Y，購于福建邁新生物有限公司）作為BRAF抗體；免疫組化試劑盒購自上海研謹生物科技有限公司；PCR反應所用試劑購自北京索萊寶科技有限公司；檢測BRAF基因突變所需使用的DNA抽提試劑盒購自北京博凌科為生物科技有限公司。

1.4實驗方法

1.4.1免疫組化采用SABC法，利用PBS代替一抗為陰性對照，采用明確BRAF陽性的大腸癌切片為陽性對照。步驟如下：取4μm厚切片，常規方法脫蠟，加入檸檬酸溶液后煮沸10 min，放至室溫，加入3％H2O2甲醇液以失活內源性過氧化物酶，加入BRAF抗體，室溫靜置5h后用PBS洗滌2次，加入二抗，室溫靜置2h后用PBS洗滌2次，使用DAB顯色，使用蘇木精復染，脫水后使用二甲苯透明、使用中性樹膠封固。

結果判斷：顯微鏡下觀察細胞核顏色為棕黃色者即提示BRAF蛋白陽性。依次閱讀每一張切片，隨機觀察10個視野，陽性腫瘤細胞占全體腫瘤細胞總數的百分比≥10%為陽性，反之即為陰性。

1.4.2基因突變的檢測①DNA的提取：取前文所述標本，根據DNA抽提試劑盒所述步驟，提取DNA于-20℃冰箱保存；②PCR擴增目標片段：引物源自華大基因公司，正向引物5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3'，反向引物5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'，擴增后目標片段長度為218bp；PCR反應體系為：總體積50μL，其中dNTP（5mmol/L） 6μL、DNA聚合酶（10U/μL）0.4μL、模板DNA 3μL、正反引物(15μmol/L)各1.0μL、擴增緩沖液(10×)5μL、雙蒸水33.6μL；反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，59℃退火30s，70℃延伸45s，進行40個循環后72℃延伸20min后結束；③電泳檢測：取步驟②所得PCR產物7.0μL，加入緩沖液1.0μL混合，以DNA標記物1.0μL作為對照，在2％瓊脂凝膠中進行電泳，并用EB染色；④PCR產物測序：由華大基因測序。

1.5統計學分析采用SPSS19.0軟件，對實驗所得數據進行χ2檢驗。

2結果

2.1 BRAF蛋白表達情況實驗組中，共92例確診PTC患者，其中BRAF蛋白表達陽性者為68例，占比73.9%。其中：男性20例陽性（陽性率74.1%），女性48例陽性（陽性率73.8%），差異不顯著；≤55歲者22例陽性（陽性率91.7%），＞55歲者46例陽性（陽性率67.6%），差異具有顯著性；腫瘤直徑≤5mm者有23例陽性（陽性率54.8%），腫瘤直徑＞5mm者45例陽性（陽性率90.0%），差異顯著；出現淋巴轉移者47例陽性（陽性率80.0%），未出現淋巴轉移者12例陽性（陽性率63.6%），差異不顯著；出現點狀鈣化者19例陽性（陽性率70.4%），未出現點狀鈣化者49例陽性（陽性率75.4%），差異不顯著；有包膜者15例陽性（陽性率68.2%），無包膜者53例陽性（陽性率75.7%），差異不顯著。見表1。

對照組中僅有1例濾泡癌患者出現BRAF蛋白陽性表達(陽性率14.3%)， 其余所有對照均陰性表達。

2.2 BRAF基因T1799A突變實驗組中，共有92例確診PTC患者，其中BRAF基因突變者為30例，突變陽性率32.6%。進一步分析突變基因堿基改變，為第1799位點的胸腺嘧啶被腺嘌呤所取代，即T1799A（圖1）；從蛋白表達角度考慮，所有突變者均陽性表達BRAF蛋白。具體分析：男性8例發生突變（突變率29.6%），女性22例發生突變（突變率33.8%），差異不顯著；≤55歲者6例發生突變（突變率25.0%），＞55歲者24例發生突變（突變率35.3%），差異不顯著；腫瘤直徑≤5mm者有7例發生突變（突變率16.7%），腫瘤直徑＞5mm者23例發生突變（突變率46.0%），差異顯著；出現淋巴轉移者20例發生突變（突變率33.9%），未出現淋巴轉移者10例發生突變（突變率30.3%），差異不顯著；出現點狀鈣化者11例發生突變（突變率40.7%），未出現點狀鈣化者19例發生突變（突變率29.2%），差異不顯著；有包膜者9例發生突變（突變率40.9%），無包膜者21例發生突變（突變率30.0%），差異不顯著。見表1。

對照組中所有病例均未檢測出突變。

圖1PTC基因測序

3討論

2002年，研究者第一次在惡性黑色素瘤中發現了BRAF基因的突變[6]，其后，BRAF基因突變被多次發現于不同的腫瘤組織內，而其在PTC中的陽性率僅次于惡性黑色素瘤，文獻[6]報道其突變率可達30%～83%。這種突變的出現具有一定的特異性，即其他甲狀腺惡性腫瘤中極少檢測到BRAF基因的突變。從本次實驗得到的PTC組BRAF基因的突變率為32.6%，與已有的文獻報道是相符合的。

作為甲狀腺惡性腫瘤中發病率最高的那種，PTC的預后也是其中最好的，特別是得益于近年甲狀腺超聲技術的發展和應用，大部分患者都能在較早期得到診斷和治療，通過手術結合131 I放射治療可以取得非常好的療效，但遺憾的是，仍然有部分患者會出現復發，甚至遠處轉移等情況。因此，為了更好地判斷PTC患者的遠期預后，就極有必要去研究患者年齡、性別、腫瘤直徑、有無頸淋巴結轉移、有無包膜、超聲征象等等影響其遠期預后的因素[7]。和遠處轉移，BRAF基因正式研究這些因素的一把鑰匙。綜合BRAF蛋白表達、BRAF基因突變的結果，我們認為腫瘤直徑與BRAF基因的相關性較為顯著，腫瘤直徑≤5mm者有7例發生突變（突變率16.7%），腫瘤直徑＞5mm者23例發生突變（突變率46.0%），腫瘤直徑大者BRAF基因的突變率明顯較高，在統計學上差異顯著。

此外，本研究也探討了BRAF蛋白在PTC患者中得情況。從結果來看，PTC患者BRAF蛋白的表達率為73.9%。結合其在余下甲狀腺惡性腫瘤中得表達率（僅濾泡癌中有14.3%，其余未見表達），可以認為BRAF蛋白在甲狀腺腫瘤的病理診斷方面具有潛在應用價值。

參考文獻：

[1]XingM．Prognosticutilityof BRAF mutation in papillary thyroid cancer［J］.Mol Cell Endocrinol，2010，321(1): 86－93

[2]HundahlSA，FlemingID，Fremgen AM.A national cance data base report on 53 856 cases of thyroid carcinoma treated in the U.S，1985-1995.

[3]PeyssonnauxC，Eychene A.The RAF/MEK/ERK pathway:new concepts of activation.

[4]周庚寅，白艷花，覺道健一．甲狀腺乳頭狀癌的病理診斷及遺傳學特點[J].臨床與實驗病理學雜志，2010，26(2):131－138.

[5]陳士超，何春年．用于甲狀腺腫瘤鑒別診斷的相關分子標記物[J].臨床與實驗病理學雜志，2007，23(3):350－353.

[6]Davies H;BignellGR;Cox C Mutations of the BRAF gene in human cancer

[7]Kim SK，SongKH，Lim SD.Clinical and pathological features and the BRAF(V600E) mutation in patients with papillary thyroid carcinorna with and withoutconcurrent Hashimoto thyroiditis

編輯/哈濤