網織血小板在急性白血病中的檢測和臨床意義

摘要：目的 探討分析急性白血病（AL）患者外周網織血小板（RP）的檢測方法以及RP檢測的臨床意義。方法 收集我院血液內科2011年9月~2013年9月住院并接受化療的AL患者30例，用流式細胞儀（FCM）動態檢測AL患者的RP、外周血血小板（PLT）水平，并計算RP百分比（RP%）和RP絕對值（RPC）。并與30例體檢健康的受試者作對照。結果 治療前，AL患者的RP%和PRC均低于健康受試者，且具有統計學差異（P<0.05），經過治療后，達到臨床緩解標準的AL患者RP%和RPC與健康受試者無顯著性差異（P>0.05）。結論 RP%和RPC不僅可以反映骨髓PLT的生成情況，而且靈敏度比PLT計數高，因此，RP%和RPC可以作為治療AL過程中的監測指標。

關鍵詞：網織血小板；流式細胞儀；急性白血病

網織血小板（Reticulated Platelets，RP）是由骨髓巨核細胞釋放進入外周血液的血小板，RP不含細胞核或者DNA成分，但含有少量的信使RNA和粗面內質網用于合成少量的蛋白質，是血液循環系統中最為年輕的血小板[1]。外周血經新亞甲藍染色后在顯微鏡下觀察到的網狀染色無的部分即為RP。RP可以反映外周血小板（Peripheral platelet， PLT）的增生情況、更新速度和骨髓造血系統的細胞動力學變化，是評判PLT生成情況的重要指標[2-3]。急性白血病（Acute Leukemia ，AL）患者PLT較健康者顯著減少，其原因復雜。在臨床診治過程中，骨髓功能狀態的變化比較大，PLT或者骨髓穿刺是臨床上判斷白血病患者不同疾病狀態的常規診斷方法，然而PLR升高或者骨髓造血功能的恢復存在明顯滯后的問題，檢驗誤差大，影響因素多等不足，并且多次骨髓穿刺給患者帶來難以忍受的痛苦。而采用流式細胞儀（FCM）、檢測PR具有簡單、準確、外周血采集量少，無需骨髓穿刺等特點，是一種新型的診斷AL患者疾病狀態的方法。應用流式細胞儀檢測RP主要是利用網織血小板內殘留的少量RNA，可以被多種不溶的核酸特異性熒光染料染色，其中較為好用的是噻唑橙（TO）。噻唑橙能夠透過存活的血小板細胞的細胞膜，與核酸結合，標記噻唑橙的血小板觀察到的熒光強度顯著增強。研究表明RP百分比（RP%）和RP絕對值（RPC）能夠反應骨髓中PLT的生成率，并且RP%能夠作為預測指標預測外周血中PLT計數的恢復情況。

1資料與方法

1.1一般資料隨機選擇2011年9月~2013年9月我院收治的30例急性白血病（AL）患者作為治療組，研究對象經免疫學、骨髓細胞學和骨髓病理學檢查證實均符合《血液病診斷和療效標準》中的診斷標準[4]。其中男性17例，女性13例，患者年齡19~60周歲，中位年齡為32周歲。同時隨機選取30例體檢健康的受試者作為對照組。其中男性17例，女性13例；患者年齡20~56周歲，中位年齡為34周歲。健康受試者篩選條件：查體肝腎功能正常；心電圖正常；五分類全自動血液細胞分析儀血常規檢測結果無異常。可排除高脂血癥、腎臟疾病，肝臟疾病、心血管疾病、糖尿病。

1.2儀器與試劑噻唑橙（TO）染料（美國Sigma公司）；CD42b單克隆抗體（PE標記）（美國BD公司）；FACS Calibur型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.3檢測方法采集靜脈血5μL，加肝素抗凝，加入10μL CD42b單克隆抗體（PE標記），再加入梯度的TO染料（用生理鹽水稀釋），并著染不同的時間，確定好實驗條件后連續監測標本10次，以檢測該方法的可重復性。FACS Calibur型流式細胞儀的設門規則參考[4]等人的方法。分離PLT與紅細胞、白細胞及碎片，并用CD41b單克隆抗體來確認PLT的比例。用對照組確定為陽性閾值，然后檢測TO染色為陽性的PLT百分比。設定PLT的檢測門，檢測獲得直方圖，按照空白對照來設置標尺，使得TO染色呈陽性的PLT為1%，檢測20000個PLT，計數TO染色呈陽性的RP，并計算RP百分率，即RP%。RP%和PLT計數結果的乘積得到的數值記為RP絕對值，即RPC。

1.4統計學方法應用SPSS16.0軟件對所有數據進行統計分析，計量資料均用\"均值±標準差（x±s）\"表示。數據比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2結果

2.1染色濃度及染色時間的篩選抽取健康受試者加油肝素的靜脈血5μL，加入10μL CD42b單克隆抗體（PE標記）后分別再加入500μL梯度稀釋的TO（稀釋比為1:1、1:2、1:3、1:4），充分混合均勻后靜置室溫避光。在染色后10、20、30、60、90、120min時，采用流式細胞儀檢測RP%。實驗結果發現當TO濃度比為1:2，染色時間為30min時，RP%的穩定性最高，是染色的最佳實驗條件。

2.2 RP%和PRC的檢測結果采用上確定好的實驗條件來檢測對照組和治療組的外周血，對照組的RP%核RPC的檢測結果為（17.49±9.31）%和（39.23±17.34）；治療組的檢測結果分別為（4.52±3.10）%和（1.32±0.89）。治療組的RP%和RPC的檢測值均小于對照組，且具有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 AL患者治療后的RP%和RPC檢測結果經過治療后，AL患者中臨床緩解的有21例，RP%和RPC的檢測結果為（15.23±8.23）%和（35.41±15.56）；未緩解的有9例，檢測結果為（8.74±3.37）%和（10.42±5.16）。未緩解患者的RP%和RPC檢測結果顯著小于健康受試者和臨床緩解患者，且具有顯著性差異（P＜0.05）。而臨床緩解患者的檢測結果與健康受試者相比，無顯著性差異（P＞0.05）。

3討論

化療及放療會導致急性白血病患者出現繼發性的骨髓抑制或衰竭，進而引起PLT減少，甚至出血的傾向。化療后，急性白血病患者PLT能夠有效恢復患者外周血的PLT水平，從而預防因為PLT減少而導致的出血。

研究發現，從化療的第22d開始接受化療的AL患者外周血的PLT水平可以自行恢復，但RPC的恢復卻比PLT提前了2d，研究者認為，因為RPC能夠提示誘導或者強化治療后患者骨髓造血功能的恢復情況，并能夠減少患者輸注PLT的次數，所以在化療期間，對AL患者進行RPC監測較PLT監測也就更有意義[5]。

目前，AL診療的依據主要是骨髓穿刺和外周血的檢查結果，然而經過化療后，PLT的動力學變化迅速，目前還沒有相關的指標能夠預測化療后PLT的恢復程度。實驗研究結果顯示，AL患者的RP%及RPC均低于健康受試者，臨床緩解的AL患者的RP%及RPC升高，且與健康受試者相比較無統計學差異，而未緩解的AL患者的RP%及RPC水平無明顯變化。

參考文獻：

[1]Kienast J，Shemitz G.Flow cyctometric analysis of thiazole orange uptake by platelets: a diagnostic acid in the evaluation of thrombocytopenic patients[J].Blood.，1990，75(1):116.

[2]Chao W，Brian RS，Kenneth A，et al.Reticulated platelet predict platelet count recovery following chemotherapy[J].Transfusion，2002，42(3):368.

[3]楊斌，曹祥山，邱國強，等.網織血小板檢測在特發性血小板減少性紫癜中的臨床意義[J].蘇州大學學報(醫學版)，2006，26(1):120-121.

[4]Takubo T，Yamane T，Hino M，et al.Clinical significance of stimultaneous measurement of reticulated platelets and large platelets in idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Haematologia(Budap)，2000，30(3):183-192.

[5]Stohlawetz P，Stiegler G， Knobl P，et al.The rise of reticulated platelets after intensive chemotherapy for AML reduces the need for platelet transfusions[J].Ann Hematol.1999，78(2):271-273.

編輯/哈濤