七氟醚對非去極化肌松藥與肌肉型乙酰膽堿受體作用的影響

摘要：目的 探討七氟醚對于非去極化肌松藥及肌肉型乙酰膽堿受體作用的影響。方法 取大鼠肌肉多聚腺嘌呤mRNA，并注入已去膜非洲爪蟾的卵母細胞之中，采用電壓鉗技術對電壓依賴性離子通道電流進行記錄。常規建立七氟醚、維庫溴銨以及羅庫溴銨抑制乙酰膽堿產生的電流量曲線，并觀察加入抑制濃度為50%的七氟醚后，維庫溴銨以及羅庫溴銨抑制作用變化。結果 七氟醚、維庫溴銨以及羅庫溴銨均具有快速、可逆、穩定以及濃度依賴性抑制作用，達到50%抑制率時的濃度分別為：823μmol/L、9.2nmol/L、33.4nmol/L。結論 七氟醚與非去極化肌松藥羅庫溴銨以及維庫溴銨能夠對突出厚膜的nAChR產生協同作用，從而增加抑制效應。

關鍵詞：乙酰膽堿；七氟醚；非極化取肌松藥物

非去極化肌松藥在臨床中應用廣泛，但麻醉中需要與其他藥物聯合應用，可能對其作用具有一定的影響。七氟醚是臨床常用的氟化吸入麻醉藥，麻醉誘導迅速，可便于麻醉深度的調節，麻醉蘇醒較快[1]。臨床研究發現，七氟醚具有肌松作用，且能夠提高非去機化肌松藥所具有的神經肌肉阻滯作用，但關于其作用機制目前尚未闡明，認為可能與其肌肉型乙酰膽堿受體（nAChR）作用有關。本研究擬用具有大鼠nAChR模型進行試驗，研究七氟醚對于非去極化肌松藥及nAChR作用的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1試驗材料 試驗動物為雌性成熟爪蟾，選自中國科學院遺傳與發育研究所，年齡為1.5～2.0年，體質量為200～250g。Wistar大鼠選自華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心。

1.2試劑與器材 應用美國Promega公司研發的新磁珠技術進行大鼠肌肉組織mRNA的提取，乙酰膽堿（Ach）、膠原酶（Ⅰ）、焦磷酸二乙酯（DEPC）以及HEPES均由Sigma公司提供，其余均為國產分析純試劑。OC-725C型卵母雙電極電壓鉗儀選自美國Warner公司；微注射器選自美國WPI公司；記錄儀選擇CytoBench系統，由華中科技大學儀博公司提供。

1.3采集卵母細胞[2] 對爪蟾進行冰浴麻醉30min，減下卵葉2～3個，并將其置于含有ND96培養液的醫用表面皿中。將單個卵母細胞分離出來，并置入無鈣的ND96培養液之中，以膠原酶Ⅰ進行消化，消化時間為1～2h，以將濾泡膜以及卵巢膜去除。選擇Ⅴ-Ⅵ期成熟卵母細胞置于ND96培養液之中，并于19℃下進行恒溫恢復數小時。

1.4制備大鼠肌肉mRNA 處死成年大鼠，并迅速將其兩側小腿的三頭肌以及伸趾長肌去除，以預冷水連續洗滌2次，并進行勻漿處理、探針退火、洗脫以及凍干等，以分離出mRNA+poly（A），置于-70℃條件下存儲。

1.5微量注射 向各個去膜卵母細胞之中注入濃度為1g/L的 mRNBA約50～100nl，并置于ND96溶液之中進行恒溫浴2～3d，每天均應換液并將壞死細胞去除。

1.6數據記錄 應用常規雙電極電壓鉗進行電生理記錄。以0.15mol/L的KCl溶液灌注電壓電極，以3mol/L的KCl溶液灌注電流電極，結束灌注后電壓電機和電流電極的阻抗分別為1-10MΩ和0.1～1MΩ左右，而鉗制電壓值為-60mV。在試驗過程中，以Ringers液進行灌流，并將灌流速度控制在3～5ml/min。合理調整蠕動泵泵速，以維持液面恒定并且無液體外流。在給藥前先進行阻斷灌流，在給藥后再予以充分灌流，給藥量控制為2.5ml/次，并維持實驗溫度在18℃～20℃，以CrtoBench進行電流變化記錄。

2 結果

自大鼠肌肉組織之中提出出來的mRNA+poly（A）經紫外分光光度儀測得A260/A280為1.9，此時蛋白質已經基本去除，所提取出的mRNA具有較好的純度，單位質量內提取的mRNA+poly（A）為（24±6.1）μg/g。由ACh能引發表達以后的卵母細胞能夠產生與之相對應的膜電流，維庫溴銨與羅庫溴銨均可引起濃度依賴性、可逆性抑制ACh，而維庫溴銨對于膜電流的抑制作用較羅庫溴銨更強，濃度分別為9.2nmol/L、33.4nmol/L。七氟醚也能夠濃度依賴性地對ACh產生抑制作用，IC50濃度值為823μmol/L。

3 討論

本研究結果顯示，單用應用七氟醚時，其對于nAChR膜電流的抑制能力很弱，其達到相應效應時所需濃度為非去極化肌松藥的數百倍。將七氟醚與非去極化肌松藥聯合應用時，臨床劑量內的羅庫溴銨以及維庫溴銨抑制效應顯著提高。nAChR是由不同亞基所組成的一種門控離子通道，具有四個亞單位區，可將其固定在突觸后膜之上，其中M2受體單位屬于親水性離子通道，該通道的內部具有異氟醚結合位點[3]。相關研究資料顯示，在鈣通道應用膜片鉗后，七氟醚能夠通過阻塞該通道而起到離子流抑制作用，可導致通道阻滯。將七氟醚聯合非去極化肌松藥聯合應用所產生的協同作用可能是由于兩者所處區域不同，而與七氟醚相結合后構象改變，從而引起拮抗劑親合力增強。提示七氟醚以及非去極化肌松藥能夠共同作用于機體突觸后膜，并產生協同作用。

綜上所述，在臨床濃度范圍之內，七氟醚與非去極化肌松藥羅庫溴銨以及維庫溴銨能夠對突出厚膜的nAChR產生共同作用，并在此位點產生協同作用，從而增加兩者的抑制效應。

參考文獻：

[1]劉力，閔蘇，魏珂，等.七氟醚和異氟醚對不同濃度羅庫溴銨抑制乙酰膽堿受體內向電流的影響[J].中國藥理學通報，2011，27（1）：113-116.

[2]王小明.不同用藥對非去極化肌松藥的應用對比研究[J].按摩與康復醫學（上旬刊），2010，01（10）：14-15.

[3]李春蓮，七氟烷對順式阿曲庫銨和羅庫溴銨肌松作用的影響[J].中國中西醫結合外科雜志，2011，17（2）：165-167.

編輯/哈濤