實時熒光定量PCR檢測MM患者IgH基因重排的表達

摘要：目的 通過對多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者聯合化療前后免疫球蛋白重鏈（Immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排進行定量分析，探討IgH基因重排在MM發病機制中的作用，及重排拷貝數與預后及療效間的關系。方法 選用實時熒光定量PCR法，檢測并比較15例MM患者化療前后IgH基因重排拷貝數變化，培養U266細胞株和K562細胞作為陽性及陰性對照，應用SPSS11.5統計軟件對結果進行統計分析。結果 用SPSS11.5統計軟件對結果進行配對秩和檢驗，化療前后IgH基因重排拷貝數變化有顯著差異（P<0.05），差異有統計學意義。結論 MM患者經過聯合化療后， IgH基因重排拷貝數比化療前有明顯降低。從而可以作為判斷MM治療療效的一種檢測方法，并對患者的預后判斷有指導意義。

關鍵詞：實時熒光定量PCR；多發性骨髓瘤；IgH重排

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以產生單克隆免疫球蛋白的異常漿細胞在骨髓內惡性增殖為特征的 B細胞系惡性腫瘤，其特征為血清單克隆性免疫球蛋白、溶骨性骨骼破壞、病理性骨折、骨痛、高鈣血癥和貧血。其發病機制目前尚不明確，隨著醫學分子生物學的進展，實時熒光定量PCR （RQ-PCR）技術近年來發展起來并已開始用于臨床，本實驗以免疫球蛋白重鏈基因重排來研究MM的發病機制，通過用實時熒光定量PCR法檢測MM患者聯合化療前后IgH基因重排拷貝數的變化，探討實時熒光定量PCR法是否可作為判斷MM治療療效的一種檢測方法，并對患者的預后判斷是否有指導意義。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1細胞株 K562細胞株（慢性粒細胞白血病急性變細胞系）由昆明醫學院第一附屬醫院臨床試驗研究中心王秦秦教授惠贈；U266細胞株（多發性骨髓瘤細胞系）由上海長征醫院侯建教授惠贈。將U266細胞作為多發性骨髓瘤的陽性對照和標準品，K562細胞作為陰性對照。

1.2病例 收集2008年8月～2009年3月在云南省昆明醫學院第一附屬醫院血液科住院治療的15例確診的MM患者。診斷療效標準參照《血液病治療及療效標準》[1]，其中初診患者3例，定期入院化療患者12例，男9例，女6例，年齡53～79歲，平均年齡62.1歲。IgG型患者9例，未分泌型患者4例，IgA型患者1例，輕鏈型患者1例。

1.3 實驗步驟

1.3.1標本采集 取患者應用聯合化療（VAP方案或VAMP方案或VAD方案或VCMP方案或沙利度胺）前及從注射化療藥物后1個月的骨髓2～3ml或外周血5ml，于枸櫞酸鈉抗凝管中保存在4℃冰箱中以備提取單個核細胞。

1.3.2單個核細胞提取 ①取標本3-5ml，于枸櫞酸鈉管中垂直靜置，加入等量PBS。②取一支新的15ml離心管，加入淋巴細胞分離液（Ficoll分離液）3ml，取上步處理過的標本貼管壁緩慢注入，使之形成上下兩層，輕放入離心托中，再用天平配平，放入離心機中，室溫下3000rpm20min離心后輕輕取出，不要震蕩，會發現試管中部有白色薄薄的單個核細胞層，用1ml移液器輕輕將其吸出后，置入另一支15ml離心管中。③再加入等體積的蒸餾水混勻，室溫放置5min后，再倍比加入1.8%Nacl輕輕混勻洗滌，3000rpm離心15min。④棄上清，留取沉淀。加入1mlPBS液混勻，用1ml移液器吸出后置入2ml離心管中，放入-20℃冰箱中凍存，以備DNA提取之用。

U266細胞株和K562細胞株省略以上步驟，經PBS洗滌后可直接提取DNA。

1.3.3患者標本DNA提取：按Genomic DNA Purification Kit試劑盒操作說明提取基因組DNA，（本試劑盒購于Fermentas 公司）。

1.3.4細胞培養 含15%胎牛血清的RPMI1640培養液培養并傳代。（胎牛血清購于杭州四季青公司；RPMI1640培養液購于hyclone公司）

1.3.5細胞株DNA提取 按Genomic DNA Purification Kit試劑盒操作說明提取基因組DNA，（本試劑盒購于Promega 公司）。

1.3.6引物設計 ：IgH通用PCR引物來源于文獻[2]，上游引物為5，-ACA CGG CCG TGT ATT ACTGT-3，下游引物為5- ACC TGA GGA GAC GGT GAC C-3；管家基因Beta-actin 用Primer Express 5.0設計，在genebank中登陸序號為：NM_001101。基因序列85-1212，產物片段110bp。核苷酸序列為：601 gccgtcaggc agctcgtagc tcttctccag ggaggagctg gaagcagccg tggccatctc；661 ttgctcgaag tccagggcga cgtagcacag cttctcctta atgtcacgca cgatttcccg；721 ctcggccgtg gtggtgaagc tgtagccgcg ctcggtgagg atcttcatga ggtagtcagt（注加粗的為 Beta-actin上下游引物序列）。兩對引物均由上海生工生物工程技術服務公司合成。

1.3.7實時熒光定量PCR反應 在7300型熒光PCR儀進行擴增。步驟：融解所需試劑及標本，振蕩混勻，短暫離心后，于光學專用8連管中配置反應體系。IGH基因 PCR擴增體系：模板DNA：2ul；上游引物：0.3ul；下游引物：0.3ul；SYBR Green I Real time PCR Master Mix：6.75ul；雙蒸水：5.65ul，總體積15ul.PCR擴增循環參數：95℃預變性10min； 95℃變性15s；57℃退火20s；68℃延伸1min；共40個循環。引物根據說明書稀釋。反應均設一陽性對照和陰性對照。

1.3.8定量方法 根據參考文獻，比較化療前后IGH基因拷貝數變化用比較CT值法做相對定量，用數學公式2-ΔΔCT 分析相對基因表達差異。采用SPSS11.5統計軟件對結果進行配對秩和檢驗（數據呈偏態分布）。

2結果

2.1患者DNA含量和純度 患者DNA得率為1～2ug/g，其吸光度OD260/OD280（純度值）為>1.7.

2.2管家基因Beta-actin實時熒光定量PCR反應結果 見圖1，圖2。

30份標本加入管家基因Beta-actin后，用實時熒光定量PCR進行擴增，得出以上擴增曲線，在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，其CT值與原始拷貝數成反比。

以上30份Beta-actin的融解曲線分析，融解曲線的峰值在86.4℃。由于非特異產物（引物二聚體）的解鏈溫度（Tm）相對特異產物低，利用融解曲線可將特異和非特異產物分開。

2.3患者IgH基因實時熒光定量PCR反應結果 見圖3，圖4。

2.4試驗數據 見表1。

2.5 統計結果 15例患者化療前后Beta-actin基因CT值經配對T檢驗，P=0.172，其差異無統計學意義（P﹥0.05）。認為Beta-actin基因拷貝數在化療前后無顯著差異，可以作為管家基因。

3討論

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM） MM是漿細胞異常增生的惡性腫瘤，占血液系統腫瘤的10%，全身惡性腫瘤的1%，并有逐年遞增的趨勢。

MM發病機制尚不明確，IgH基因重排作為MM 發病機制新的研究方向，國內外研究者已有相關報道[3]。80年代，國外學者用Southern blot技術檢測IgH基因重排。Oster等[4]檢測20例MM患者外周血單個核細胞，8例有 IgH基因重排。Riet等[5] 用免疫磁化法分離出B細胞，檢測12例患者骨髓及外周血，骨髓中9例陽性，外周血僅2例陽性。Ralph等[6] 用PCR技術檢測了21例MM患者的骨髓涂片，16例陽性（76.1% ）。Trainor 等 檢測10例MM外周血，陽性者6例。雖然利用定性PCR檢測MMIgH重鏈重排已取得了較大的進展，但是費時、步驟繁瑣、假陽性高。Dobbs等采用熒光定量 PCR 方法，對 140例 B淋巴細胞系統惡性腫瘤（ALL，CLL，MCL，）患者的淋巴結、外周血、骨髓和石蠟組織檢測 IgH基因重排，結果56例檢測到 IgH基因重排，與常規的PCR方法相比，敏感性為88.9%，特異性 100%。研究表明，使用熒光定量PCR檢測 IgH基因重排是一種可靠的檢測方法，可以對判斷治療的療效及預后提供一種新的衡量指標。

本實驗中MM患者采用化學治療的方案有：VAP（長春新堿，阿霉素、潑尼松）方案、VAD方案、MP方案、VAMP（長春新堿，馬法蘭，阿霉素、潑尼松）方案、VCMP方、VAD聯合沙利度胺、沙利度胺聯合潑尼松、VAMP聯合沙利度胺。入選試驗中的15例患者，分別在化療前及正規化療一療程后采集骨髓液或外周血并提取DNA，用實時熒光定量PCR法對IgH基因重排拷貝數進行檢測，用非參數秩和檢驗方法對結果進行統計分析可得P<0.05，其差異有統計學意義，可以認為化療后IgH基因重排拷貝數較化療前有顯著差異。本實驗中采用比較CT值法做相對定量，反應的是拷貝數的相對變化，在目前的研究中，拷貝數究竟下降多少倍才達到完全緩解還沒有統一的標準，但我們通過比較化療前后拷貝數的變化并結合臨床資料綜合分析，可以對化療療效做出初步判斷，并可能對預后有一定的指導意義。

參考文獻：

[1]張之南.血液病治療及療效標準[M]，北京：科技出版社，1998：168-178.

[2]林法迎，侯 建等. 實時定量 PCR監測 MM患者反應停治療后微小殘留病[J]. 上海免疫學雜志，2003，23（ 4）.

[3] Gibson UE， CA Heid and PM Willianms. A novel method for real time quantitative RT-PCR.Genome Res.1996.6：995-1001.

[4]Oster W， Linelemann A， Mertelsmamn R， et al. Minimal peripheral blood cells carrying elonal markers of B cell disorderaI evidence for monoetonality of circulating tyropho- eytes in patients with multiple myeloma.Intern J cell Cloning，1989，7：111.

[5]Rlet IV. Heirman C. Lacor P， et al. Detection of monoclonal B lymphocytes in bone marrow and peripheral of multiple myeloma patients by immunogtobulin gene rearrangement studies.Br J Haematol，1989.73：289.

[6]Ralph QM， Briseo MJ， Joshul DE， et al. Advancement of multiple myeloma from disease through plateau phase to progression does not involve a new B-cell c Lone：evidence from the immunnglobin heavy chain gene.BLood，1993.88：202.

編輯/王海靜