蛭龍活血通瘀膠囊對局灶性腦缺血大鼠腦組織TGF—β1表達的影響研究楊思進

摘要：目的 探討蛭龍活血通瘀膠囊對局灶性腦缺血大鼠腦缺血區TGF-β1表達的影響。方法 將120只健康雄性成年SD大鼠，體重（250～300）g，隨機分為六組（另30只備用）：假手術組、模型組、蛭龍活血通瘀膠囊高劑量組、蛭龍活血通瘀膠囊中劑量組、蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組、步長腦心通對照組，每組20只。以Zea longa法為標準制作大鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）模型，假手術組只行正中切口，但不插入線栓。各用藥組均在動物蘇醒后灌胃，假手術組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續7 d（n=20）。術后7 d，心臟灌注固定，斷頭取腦，采用免疫組化方法檢測大腦皮層缺血區TGF-β1的蛋白表達。結果 蛭龍活血通瘀膠囊治療組大鼠腦組織缺血區TGF-β1表達較模型組明顯升高。結論 蛭龍活血通瘀膠囊可能通過神經內分泌-免疫網絡使缺血皮質神經元和膠質細胞TGF-β1表達顯著增加，促進血管再生，修復損失腦組織，從而發揮腦保護作用。

關鍵詞：蛭龍活血通瘀膠囊；腦缺血；轉化生長因子-β1

轉化生長因子（Transforming growth faetor-β1，TGF-β1）是一種普遍存在的細胞因子，其作用涉及細胞生長、分化、炎癥和組織修復。近年來研究表明[1-2]，在缺血性腦損傷中TGF-β1有抗氧化、阻止細胞凋亡、調節炎癥反應以及膠質細胞和星形細胞反應的多種作用。蛭龍活血通瘀膠囊系由黃芪、水蛭、地龍、大血藤等組成的復方制劑，具有益氣活血化瘀通絡，祛風的功效。我們觀察發現蛭龍活血通瘀膠囊能明顯促進局灶性腦缺血大鼠神經功能恢復，其機制可能與促進缺血腦組織TGF-β1表達有關。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1動物 健康雄性成年SD大鼠150只，體重250～300 g，皮膚光滑潤澤，呼吸道通暢，清潔級，由瀘州醫學院動物實驗中心提供。

1.1.2試劑與藥物 TGF-β1單克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司，批號：G57121。磷酸鹽緩沖液（PBS）， 北京四正柏生物科技有限公司。DAB顯色試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司。蛭龍活血通瘀膠囊：由瀘州醫學院附屬中醫院制劑室提供。批號：20121212；步長腦心通膠囊：咸陽步長制藥有限公司產品，批號：1209955。

1.2方法

1.2.1造模方法及動物分組 參照Zea longa等[3-5]報道的線栓改良法造模，造模動物在自然蘇醒后，參照Zealonga評分[3]標準進行5分制評分，評分標準：無神經損傷癥狀，0分；不能完全伸展對側前爪，1分；向外側轉圈，2分；行走時向對側傾倒，3分；不能自發行走，意識昏迷，4分。將術后24 h評分為1～3分的大鼠選入組，其余動物剔除，并作隨機補充。用隨機數字表法分為6組，即蛭龍活血通瘀膠囊高劑量組、蛭龍活血通瘀膠囊中劑量組、蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組、步長腦心通膠囊對照組、腦缺血模型組和假手術組。

1.2.2藥物干預 蛭龍活血通瘀膠囊成人的臨床用藥量為4.8 g/d。按人體用量的5、10、20倍，成人體重按60 Kg計算，換算為動物低、中、高劑量組的用藥量，分別為0.4 g/Kg/d、0.8 g/Kg/d、1.6 g/Kg/d；對照組按成人用量的10倍給藥，即0.8 g/Kg/d。各藥物干預組大鼠均給予等體積（3 mL）相應濃度的藥物灌胃，假手術組及模型組大鼠給予等體積（3 mL）的生理鹽水灌胃，1次/d，連續7 d，并按體重調整給藥量。

1.2.3指標采集及檢測方法

1.2.3.1免疫組化標本制備及檢測 腦缺血7 d后，各組大鼠均腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/Kg）腹腔麻醉后，頸動脈放血后，打開胸腔，暴露心臟，將灌注插管從心尖（左心室）部位插入直至左心室升主動脈，同時剪開右心耳，先灌注20℃的0.9%生理鹽水200 mL，然后灌注4℃的4%多聚甲醛200 mL，灌注后，大鼠肺部、肝臟、以及全身肌肉變得僵硬，為灌注成功。迅速斷頭，剝取腦組織，去除嗅球和小腦，在視交叉前后2 mm處冠狀切取腦組織，置于4℃的4%多聚甲醛固定48 h后，進行常規脫水石蠟包埋，連續切片，片厚約5 μm，每隔5張取1張，SP法Ang-1、Tie-2免疫組化染色，DAB顯色。任何被TGF-β1抗體染成棕黃色或棕褐色細胞均可視為陽性表達。

1.2.3.2計算機圖像分析 將切片于光鏡下放大400倍，采用Image-Pro-Plus 6.0圖像分析軟件進行圖像分析，每例大鼠隨機選取3張切片，每張切片隨機選擇3個不同視野，計數視野內陽性細胞數（被染成棕黃色或棕褐色為陽性細胞），每組所有照片的平均陽性細胞數代表該組的陽性細胞數。

1.2.3.3統計學方法 計量資料以均數±標準差（x±s）表示，使用SPSS11.5軟件進行統計學處理，組間差異采用方差分析（One Way Aonva），兩兩對比采用t檢驗。P<0.05為具有統計學意義，P<0.01為有顯著統計學差異。

2結果

各組大鼠腦組織TGF-β1陽性表達 TGF-β1在假手術組大鼠腦組織極少量陽性表達。模型組大鼠腦缺血區吞噬細胞陽性表達較假手術組增強，差異有統計學意義（P<0.05）。蛭龍高劑量組、中劑量組及低劑量組大鼠腦缺血區小膠質細胞和吞噬細胞陽性表達明顯增加，均強于模型組（P<0.01或P<0.05），以高劑量組尤為顯著，見表1，圖1。

3討論

TGF-β1是一種有效的免疫調節劑，它可以參與炎癥反應和組織修復，對細胞的生長、分化和免疫功能都具有重要的調節作用。TGF-β1在正常腦組織中的表達水平不高，一般只在大腦皮質、腦膜、脈絡叢處可檢測到，但在病理條件下則明顯升高[6]。

本實驗發現，與模型組比較，蛭龍高劑量組、中劑量組及步長對照組大鼠腦組織TGF-β1表達明顯升高（P<0.05），低劑量組大鼠腦組織TGF-β1表達有所升高，但無顯著性差異（P>0.05）。而TGF-β1在腦缺血后TGF-β1表達增加可通過以下途徑發揮腦保護作用：①促進血管生成：TGF-β1可以激活缺血半暗帶的血管內皮細胞，促進微血管的增長，促進缺血區側支循環的建立；②發揮神經保護作用：TGF-β1能降低Ca2+的濃度，維持Ca2+的體內平衡，刺激bcl-2的產生，上調腦源性神經營養因子的產生，導致TGF-β1在神經元內自身合成，同時TGF-β1可延長神經元的存活，抑制星形膠質分化，刺激星形膠質細胞釋放蛋白酶抑制劑；③抑制中性粒細胞的粘附：TGF-β1對致炎性細胞因子TNF-α具有明顯拮抗作用，并同時減少粘附受體表達來降低中性粒細胞與內皮細胞間的粘附，具有免疫下調作用；④降低其他細胞因子如TNF-α、IL-1β的表達；⑤加強對損傷腦組織的修復：TGF-β1刺激細胞外基質（ECM）的產生，抑制蛋白酶和基質酶的活性，從而促使ECM沉積， ECM的積聚對損傷后組織的修復有利。蛭龍活血通瘀膠囊治療組TGF-β1表達較模型組明顯增加，說明蛭龍活血通瘀膠囊可能通過神經內分泌-免疫網絡使缺血皮質神經元和膠質細胞TGF-β1表達顯著增加，促進血管再生，從而發揮腦保護作用。

參考文獻：

[1]Longa EZ， Weinstin PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J].Stroke，1989，20（1）：84-91.

[2]黃斌，王興勇，匡鳳梧，等.線栓法制備Wistar大鼠局灶性腦缺血模型的實驗研究[J].現代醫藥衛生，2005，21（15）：1935-1937.

[3]劉運泉，戴穎.線栓法大鼠局灶性腦缺血模型的改進[J].中國臨床解剖學雜志，2005，23（2）：222-223.

[4]Krupinski J， Kumar P， Kumar S， et al. Increased expression of TGF-β1 in brain tissue after ischemic stroke in human. Stroke，1996，27（5）：852.

[5]Gamble JR， Khew-Goodall Y， Vadas MA， et al. Transforming growth factor beta-1 inhibits E-select in expression on human endothelial cells.J Immunol，1993，150（10）：4493.

[6]錢忠信，李巍，包曉群，等.轉化生長因子與腦缺血[J].中風與神經疾病雜志，1999，16（4）：254.

編輯/張燕