同型半胱氨酸對血管平滑肌細胞中PTEN甲基化的影響

摘要：目的 探討同型半胱氨酸（homocysteine， Hcy）磷酸酶與張力蛋白同源缺失性基因 （phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten， PTEN）啟動子區DNA甲基化的影響。方法 原代培養血管平滑肌細胞（VSMCs），100 M Hcy刺激48h后，以實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測PTEN mRNA 表達水平的變化，western blot檢測PTEN蛋白表達變化；生物信息學分析PTEN啟動子區CpG島，巢式降落時甲基化特異性PCR（nMS-PCR）檢測PTEN DNA甲基化水平。結果 與正常對照組相比（0 M Hcy），給予100 M Hcy刺激后，VSMCs中PTEN mRNA 及蛋白表達水平均降低；其啟動子區存在數個CpG島，其DNA甲基化水平升高。結論 Hcy可下調VSMCs中PTEN的表達，而PTEN DNA啟動子區的高甲基化可能在這一過程中起到關鍵調控作用。

關鍵詞：同型半胱氨酸；PTEN；DNA甲基化；血管平滑肌細胞；動脈粥樣硬化

血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）的活化、增殖等改變是動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）形成的中心環節。同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是AS的獨立危險因子[1]，可以促進VSMCs的增殖[2]。磷酸酶與張力蛋白同源缺失性基因 （phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten， PTEN） 在細胞的生長、存活、遷移、分化等過程中發揮了重要作用。但Hcy是否通過影響PTEN DNA甲基化影響其在血管平滑肌細胞的表達目前未見報道。本研究用Hcy干預VSMCs，檢測PTEN mRNA、蛋白表達其啟動子區 DNA甲基化水平，為今后研究Hcy導致AS的發生發展機制打下基礎。

1資料與方法

1.1一般資料 原代人臍靜脈平滑肌細胞由本實驗室培養；DMEM培養基、胎牛血清、胰酶購自Hyclone公司；逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自Fermentas公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；DNA抽提試劑盒購自北京百泰克；DNA甲基化修飾試劑盒購自美國ZYMO RESEARCH；兔抗人PTEN抗體、兔抗β-actin、辣根酶標記羊抗兔IgG 購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原代細胞人臍靜脈平滑肌細胞培養與鑒定 采用于海嬌[2]等方法培養及鑒定原代培養的人臍靜脈平滑肌細胞。

1.2.2熒光定量PCR檢測PTEN mRNA的表達 將上述轉染pEGFP-PTEN的細胞用TRIzol法提取總RNA并反轉錄為c-DNA行熒光定量PCR檢測PTEN mRNA的表達。以GAPDH為內參照，根據PCR儀自動生成的Ct值，根據公式計算目的基因的相對量：相對表達量=2-△△Ct。

1.2.3 western blot檢測PTEN 蛋白的表達 按照全蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白進行SDS-PAGE 電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗膜；1：500 稀釋的抗PTEN 蛋白抗體，1：1000 稀釋的抗β-actin抗體 4℃孵育過夜，TBST洗膜；辣根過氧化物酶（1：3000）室溫標記1 h，TBST洗膜；凝膠成像系統分析，以β-actin 蛋白為內參，用PTEN與β-actin條帶像素灰度的比值表示PTEN 蛋白的相對表達量。

1.2.4巢式降落式甲基化特異性 PCR（nMS- PCR）檢測PTEN啟動子區 DNA 甲基化程度 根據DNA 提取試劑盒說明書提取基因組 DNA，用亞硫酸鹽修飾法對 DNA 進行修飾，設計外引物及甲基化引物（M）及非甲基化引物（U），PTEN外 引 物 上 游：5'-TTGGAAAGTTTTTT AATTAGGGATA-3'， 下游：5'- TTTCAAAAACCCAAA AAACAC-3'，產物長度為445bp；M上游：5'-GTGATTTTT TTCGGAAAGTAGTTTC-3'，下游：5'-TAAAAACC CGACAAA ATAAATCG-3'；U上游：5'-ATTTTT TTTGGAAAGTA GTTTTGA-3'，下 游：5'-AAAACCCA ACAAAATAAATCACC-3'。甲基化產物為211bp，非甲基化產物為207 bp，反應后取終產物在2%瓊脂糖凝膠電泳，分析光密度，按如下公式進行結果的計算：甲基化（%）=OD甲基化/OD甲基化+OD非甲基化]。

1.3統計學分析 結果以x±s表示，應用SPSS 11.0統計學軟件進行統計學分析，采用t檢驗進行兩樣本間比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1原代人臍靜脈平滑肌細胞培養與鑒定 細胞培養第8d時，相差顯微鏡下可看到長梭形細胞從組織塊邊緣萌出，此后細胞沿貼塊周圍放射狀生長；培養12d左右，細胞成束平行排列，高低起伏，呈現平滑肌細胞特征性的\"峰\"、\"谷\"狀生長。經α-actin免疫細胞化學染色后98%的細胞呈陽性，即胞漿呈細顆粒狀棕黃色沉淀，細胞核為淡藍色。

2.2 Hcy對PTEN mRNA及蛋白水平的影響 Hcy干預VSMCs后，分別檢測PTEN mRNA及蛋白表達水平，結果顯示與對照組相比，Hcy干預組mRNA及蛋白水平表達降低（P<0.01）（圖1）。

2.3生物信息學分析PTEN啟動子區CpG島 選取PTEN基因上游2200bp作為研究對象， 生物信息學軟件分析發現PTEN啟動子區含有5個CpG島，提示PTEN基因很可能受到甲基化的調控。

2.4 Hcy對PTEN甲基化程度變化的影響 用Hcy 干預的VSMCs，利用ntMS-PCR法檢測PTEN甲基化程度變化，如圖2所示，結果顯示與Control組比，Hcy干預組PTEN甲基化程度明顯升高（P<0.01）。

3討論

PTEN作為一種多功能的調節因子，近年來在AS中的作用越來越受到關注。PTEN 基因可以通過作用于上游的重要增殖信號轉導通路而抑制VSMC 增殖和遷移，且增加誘導其凋亡[3]。而本研究發現Hcy能夠下調PTEN mRNA和蛋白水平的表達，提示Hcy通過調節PTEN的表達參與了VSMCs的增殖。

DNA甲基化是表遺傳范疇的重要內容之一，一般來說，基因啟動子區的DNA高甲基化意味著基因的沉默，而低甲基化表示基因的激活。DNA甲基化一般發生在CpG聚集的地方，特別是在CpG 島上。在AS形成中，國內外先后報道了LDL受體等[4]的DNA甲基化改變。本課題組前期研究在人臍靜脈細胞培養的過程中加入臨床相關濃度的Hcy培養，觀察到全基因組、ApoE等基因低甲基化現象。本研究利用生物信息學軟件分析發現PTEN啟動子區存在5個CpG島，提示PTEN基因很可能受到甲基化的調控。而用Hcy 干預VSMCs后發現PTEN啟動子區發生高甲基化變化。以上結果提示Hcy影響了PTEN啟動子區甲基化程度變化，使其高甲基化，從而導致了其低表達，參與了VSMCs的增殖過程。

綜上所述，本研究發現Hcy可以使 VSMCs中PTEN的表達下調，而PTEN DNA啟動子區的高甲基化可能在這一過程中起到關鍵調控作用。

參考文獻：

[1]Cacciapuoti F.Hyper-homocysteinemia：a novel risk factor or a powerful marker for cardiovascular diseases Pathogenetic and therapeutical uncertainties [J].J Thromb Thrombolysis， 2011， 32（1）：82-88.

[2]于海嬌，馬琳娜，徐支芳，等.同型半胱氨酸對血管平滑肌細胞周期及P27和CyclinA表達的影響[J].中國現代醫學雜志，2011，21（36）： 4487-4492.

[3]Rahmani A，et al.Clinicopathological significance of PTEN and bcl2 expressions in oral squamous cell carcinoma[J].International Journal of Clinical and Experimental Pathology， 2012， 5（7）：965-971.

[4]Huang Y.ifferent effects of homocysteine and oxidized low density lipoprotein on methylation status in the promoter region of the estrogen receptor alpha gene. Acta Biochim Biophys Sin （Shanghai），2007，39（1）：19-26.

編輯/申磊