抑制IL—17活性短肽疫苗的抗動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用

摘要：目的 將具有抑制IL-17活性的短肽疫苗主動(dòng)免疫ApoE-/-小鼠，研究IL-17疫苗對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用。方法 選取8 w齡健康雄性ApoE-/-小鼠，分兩組，一組用生理鹽水腹腔注射，一組用IL-17疫苗（0002）腹腔注射，每組12只，分別于0、2、4、6 w共免疫4次，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)體重，以自動(dòng)分析儀檢測(cè)血清中血脂含量，留取心臟以油紅染色的方法檢測(cè)主動(dòng)脈瓣環(huán)及主動(dòng)脈大體標(biāo)本的斑塊面積及其成分分析。結(jié)果 結(jié)果表明IL-17疫苗（0002）在未影響小鼠體重及血脂情況下顯著的減少斑塊面積（P<0.01）。結(jié)論 通過誘導(dǎo)產(chǎn)生具有靶向阻斷作用的中和性抗體來產(chǎn)生作用的IL-17疫苗，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新思路。

關(guān)鍵詞：抑制IL-17活性短肽疫苗；ApoE-/-小鼠；動(dòng)脈粥樣硬化；斑塊面積

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）及其心血管并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類健康。現(xiàn)代研究證實(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化是一種緩慢進(jìn)展性自身免疫性血管疾病。T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的主要免疫細(xì)胞[1]，按照其功能不同可以分為多種亞群，如Th1、Th2、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等。以往的研究證實(shí)，AS動(dòng)物模型和冠心病患者體內(nèi)存在Th1細(xì)胞功能亢進(jìn)和Treg細(xì)胞功能減低，抑制Th1細(xì)胞功能可以延緩AS進(jìn)程[2-3]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體存在一種新型的不同于Th1和Th2的CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞，該細(xì)胞特異性的產(chǎn)生白介素17（IL-17），稱為Th17細(xì)胞。有研究表明，冠心病患者和AS小鼠體內(nèi)存在Th17細(xì)胞功能亢進(jìn)，應(yīng)用抗IL-17抗體干預(yù)可以顯著減少AS斑塊面積，提示IL-17在AS發(fā)病中起到重要促進(jìn)作用。因此，有理由針對(duì)IL-17這一靶點(diǎn)，進(jìn)行免疫學(xué)干預(yù)，為AS的防治提供新思路。我們的前期實(shí)驗(yàn)篩選設(shè)計(jì)了4條IL-17肽段（0001、0002、0003、0004），通過實(shí)驗(yàn)證明了所制備的IL-17疫苗（0002）所產(chǎn)生的抗體具有高度的特異性、穩(wěn)定性及中和活性，并發(fā)現(xiàn)此短肽疫苗能有效引起小鼠的免疫反應(yīng)。為了研究IL-17疫苗對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用，我們將篩選出短肽免疫ApoE-/-小鼠，進(jìn)行該疫苗對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的有效性以及安全性實(shí)驗(yàn)。

1資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)近交系C57BL/6J背景ApoE-/-小鼠，購自Jackson試驗(yàn)室（Bar Harbor， Maine， 美國），由北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖。

1.2主要試劑 冰凍切片及油紅O染色：①O.C.T包埋劑；②4%多聚甲醛：多聚甲醛粉（sigma） 4 g，PBS 100 mL，水浴加熱攪拌助溶，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.6，4℃避光保存?zhèn)溆?；③油紅O儲(chǔ)備液：油紅O（sigma）0.5 g，異丙醇100 mL，倒入燒瓶?jī)?nèi)，水浴中加熱溶解，靜置冷卻后過濾，4℃避光保存；④油紅O工作液：油紅O儲(chǔ)備液 3份，蒸餾水 2份，混合后靜置10 min，過濾后避光保存。

1.3動(dòng)物模型及基本情況 本實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定，并得到華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究委員會(huì)審核及認(rèn)可。8 w齡雄性ApoE-/-24只，SPF環(huán)境中普食飲食喂養(yǎng)，分兩組，一組用生理鹽水腹腔注射，一組用IL-17疫苗（0002）腹腔注射，注射劑量見表1，分別于0、2、4、6 w共免疫4次，測(cè)體重，8 w后心室采血處死，血清50 uL每份分裝保存于-20℃冰箱。以自動(dòng)分析儀檢測(cè)血清中血脂含量，包括：總膽固醇（TC），甘油三酯（TG）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），見表1。

1.4油紅染色及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積計(jì)算 小鼠采血處死后，快速分離其心臟及相連的部分升主動(dòng)脈，小心剃除包裹的脂肪及結(jié)締組織，PBS沖洗干凈后，濾紙吸干，4%多聚甲醛中固定12～24 h，濾紙吸干，刀片齊左右心耳下緣平面橫斷，棄心尖部心臟，以心底面朝上主動(dòng)脈部朝下的方向O.C.T包埋于鐵托上，置于冰凍切片機(jī)速凍10 min左右待包埋劑凍硬，開始對(duì)主動(dòng)脈根部進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚10 um，從主動(dòng)脈瓣環(huán)出現(xiàn)開始計(jì)數(shù)至瓣環(huán)消失，每200 um處取一切片用于油紅O染色。染色后的切片在帶攝像頭顯微鏡下拍照，單人盲法，用IMAGEPRO PLUS software（IPP）計(jì)算每片切片斑塊面積，再計(jì)算每只小鼠所有切片的平均面積。油紅O染色步驟如下：①冰凍切片于新鮮配制的60%異丙醇中漂洗20～30 s；②新鮮配制油紅O工作液中染色時(shí)間15～30 min；③于60%異丙醇漂洗，去多余油紅；④蒸餾水稍洗；⑤蘇木素中復(fù)染10～15 s；⑥1%新鮮配制氨水中返藍(lán)5～10 s；⑦自來水沖洗3～5 min；⑧于顯微鏡下拍照。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)值變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有顯著性意義。

3結(jié)果

3.1體重及血脂 在8 w的普食喂養(yǎng)過程中，小鼠均生長(zhǎng)良好。與對(duì)照相比，腹腔注射IL-17疫苗（0002）并沒有對(duì)ApoE-/-小鼠的體重及血脂造成影響，見表2。

3.2 IL-17疫苗減少斑塊面積 本次實(shí)驗(yàn)中，8 w齡雄性普食喂養(yǎng)8 w，分別于0、2、4、6 w對(duì)IL-17疫苗（0002）與對(duì)照組共免疫4次，處死小鼠對(duì)兩組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部冰凍切片并行油紅O染色并分析斑塊面積，結(jié)果表明，IL-17疫苗（0002）治療組斑塊面積明顯較對(duì)照組?。?.13±0.04 vs 0.25±0.05 mm2，P<0.01，見圖1及圖2。

IL-17疫苗（0002） 對(duì)照組

圖1

圖2 主動(dòng)脈根部斑塊面積統(tǒng)計(jì)圖

3討論

有研究表明以IL-17抗體處理的動(dòng)脈粥樣硬化自發(fā)小鼠，與對(duì)照組相比病理改變程度有所減輕，而臨床上也證實(shí)了IL-17抗體能改善同為Th17細(xì)胞為主導(dǎo)作用的銀屑病的早期臨床癥狀?；谝陨侠碚摵蛯?shí)踐基礎(chǔ)，我們認(rèn)為基于IL-17活性位點(diǎn)設(shè)計(jì)的IL-17疫苗，能通過在體誘導(dǎo)IL-17中和性抗體的產(chǎn)生而達(dá)到阻斷動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用。 我們通過IL-17疫苗（0002）主動(dòng)免疫ApoE-/-小鼠而抑制其體內(nèi)IL-17 功能，結(jié)果表明IL-17疫苗（0002）在未影響小鼠體重及血脂情況下顯著的減少斑塊面積（P<0.01）。因此，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生具有靶向阻斷作用的中和性抗體來產(chǎn)生作用的IL-17疫苗，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新思路。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/張燕