分子技術在流感病毒診斷中的應用

摘要：本文主要從定性PCR擴增，實時熒光定量RT-PCR，測序法，基因芯片技術這4個方面分析了分子技術在流感病毒診斷中的應用，從而為分子生物學的應用提供了方向。

關鍵詞：分子技術；流感病毒診斷；定性PCR；RT-PCR；測序法；基因芯片技術

流行性感冒病毒（influenza virus）屬于是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表種，簡稱流感病毒。人流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒（流感）的病原體。其中甲型流感病毒抗原性易發(fā)生變異，多次引起世界性大流行。乙型流感病毒對人類致病性較低；丙型流感病毒只引起人類不明顯的或輕微的上呼吸道感染，很少造成流行。甲型流感病毒于1933年分離成功，乙型流感病毒于1940年獲得，丙型流感病毒直到1949年才成功分離。分子技術應用于流感病毒的診斷對分子生物學以及醫(yī)學研究和社會發(fā)展具有重要意義。

1 定性PCR擴增：逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）

逆轉錄-聚合酶鏈反應（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）的科學原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。將逆轉錄-聚合酶鏈反應用來鑒別當前的流感病毒的型別，使用的擴增片段一般應該具有高度保守序列的核蛋白以及M蛋白；如果用逆轉錄-聚合酶鏈反應來鑒定一種流感病毒的亞型，那么就應該針對編碼表面的抗原基因具有的保守序列去設計引物。

根據(jù)目前相關生物研究所對HA的研究，各中流感亞型病毒HA蛋白裂解位點的氨基酸是不同的，HA即是血凝素，紅血球凝聚素。在流感的病毒的表面存在兩種蛋白質，一種稱為紅血球凝聚素（hemagglutinin），另一種為神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase）。高致病性禽流感病毒H5N1中的“H”指代前者，“N”指代后者。而就目前而言，紅血球凝聚素有16（H1～H16）種形態(tài)，神經(jīng)氨酸酶則有9（N1～N9）種形態(tài)。血凝素蛋白水解后分為輕鏈和重鏈兩部分，后者可以與宿主細胞膜上的唾液酸受體相結合，前者則可以協(xié)助病毒包膜與宿主細胞膜相互融合。血凝素在病毒導入宿主細胞的過程中扮演了重要角色。

2 實時熒光定量RT-PCR

實時PCR（real time-PCR）。實時PCR也就是指利用熒光信號累積進行實時監(jiān)測整個PCR的進程，然后以標準曲線或者公式法來定性和定量對流感病毒中的RNA模板進行分析。對實時技術來說，它指的是在同管內去進行擴增以及檢測，這也是是分生物分子技術診斷方法進步的標志，對于這種定量所使用熒光色素來說，目前研究以及醫(yī)學臨床的所用的熒光探針還是較多的，主要是由以下的多種構成：熒光共振能量轉移（FRET）雜交雙探針、YBR gr een熒光染料法以及Taqman水解探針（cleavage-based pr obes）等等，其中Taqman水解探針一般是用于檢測H1N1流感病毒，它的敏感性高達110 copy/mL。

熒光定量PCR技術。熒光定量PCR技術是基于PCR技術基礎之上的。這種技術具有能夠對DNA的高效擴增、以及探針技術的高特異性，光譜技術的高度敏感性以及定量等等的優(yōu)點，實時熒光定量RT-PCR主要擁有以下的優(yōu)勢：快速，以及能夠對反應體系的PCR產物進行實時的監(jiān)控，也就是當PCR結束之時即獲得了檢測的結果，整個過程只需要維持2h；經(jīng)濟，這種技術在病毒檢測中應用能夠節(jié)省電泳以及染色，避免反應體系的產物被污染；靈敏度高，由于實時熒光定量RT-PCR采用了特異性的熒光探針以及高靈敏度的CCD技術，使檢測相比傳統(tǒng)的PCR方法在靈敏度方面高達100～1 000倍并提高了檢測的準確性。

3 測序法

在逆轉錄-聚合酶鏈反應過程中，當RT-PCR和實時RT-PCR不能獲得流感病毒的基因序列信息以及在反應過程中檢測出流感病毒的型別卻不能分型的時候，可以采取對RT-PCR的反應體系的產物進行測序，和對流感病毒進行鑒定以及流感病毒的亞型判斷還有它的致病性分析。這也就是說當沒有具體的流感病毒的檢測方法，我們可以將測序作為對病毒檢測的臨時檢測方法。測序法的另外一個好處就是，如果有新流感亞型病毒出現(xiàn)的時候，這種測序的檢測方法不僅能夠檢測出這種新的病毒亞型，而且還能夠作為其他檢測方法的驗證實驗。

4 基因芯片

基因芯片，它的技術原理和經(jīng)典核基因芯片到底技術原理是一樣的，具體到流感病毒的檢測中也就是針對流感病毒的基因組序列的保守區(qū)域，進行特異性檢測探針的設計，同時制備流感病毒的檢測芯片，進而對流感病毒的病毒靶序列使用限制性的顯示技術進行標記，最后將這種標記的產物與基因芯片進行雜交清洗以及掃描，之后對結果進行科學的分析?？偟膩碚f，這種方法對流感病毒以及其亞型的早期檢測是極其有效的，具有高敏感性以及高通量和高靈敏度，檢測的準確性也極高。

總而言之，由于時代的不斷向前的發(fā)展以及生物科學技術的提高，生物分子技術應用于醫(yī)院臨床研究也開始成為的生物分子科學發(fā)展的必然趨勢。就前文所述的生物分子技術，多重熒光RT-PCR，由于它本身具有快速、靈敏以及特異的優(yōu)點，能夠迅速快捷準確的得出檢測的結果，可以將它應用于流感病毒的快速診斷中，不僅如此，由于流感病毒的變異性極強，因此應用生物分子技術對它檢測而具有其他檢測技術沒有的優(yōu)勢-能夠迅速的判斷出病毒的種類。隨著生物分子技術的不斷進步，這使得流感病毒的快速確證性診斷已經(jīng)成為可能發(fā)生的事實，有其是在流感大暴發(fā)時期，這種技術的應用能夠快速的控制流感病毒的蔓延，生物分子，所以，對分子技術在流感病毒診斷中的應用分析是有其必要性的，這對醫(yī)學以及生物分子學還有社會的穩(wěn)定和諧來說，都具有積極的意義[1-5]。

參考文獻：

[1]Yea C，Adachi D，Johnson G，et al.Design of a single tube RT-PCR assay for the diagnosis of human infection with highly pathogenic influenza A（H 5）viruses[J].J Virol Methods，2007，13（2）：220-226.

[2]蔡欣，朱澤軼，鄒民吉，等.流感病毒診斷方法的研究進展[J].醫(yī)學研究雜志，2009，38（5）：7-9.

[3汪維鵬，武海萍，周國華.焦測序法檢測禽流感[J].分析化學，2008，36（6）：775-780.

[4]姜曉慧，陳寅，盧亦愚，等.甲3型流行性感冒病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測方法的建立與應用[J].中國疫苗和免疫，2008，14（3）：242-245.

[5]黃文林.分子病毒學[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：431-450.

編輯/蘇小梅