葉酸、維生素B12對HHcy小鼠血清TNF—α、IL—6干預作用的研究

摘要：目的 探討葉酸、維生素B12（VB12）對高同型半胱氨酸血癥（HHcy）ApoE-/-小鼠血清TNF-α、IL-6的干預效應。方法 健康5周齡雄性純合子ApoE-/-小鼠（SPF級近交系）36只，隨機平均分為三組：模型對照組、HHcy組、干預組；另選健康5w齡雄鼠（SPF級C57BL/6J）12只作為正常對照組。喂養18w后處死，眼球取血并采用酶聯免疫吸附實驗（Elisa）方法測定血清Hcy及TNF-α、IL-6水平。結果 HHcy組血清同型半胱氨酸Hcy、TNF-α、IL-6水平明顯高于正常對照組與模型對照組（P<0.01）；干預組Hcy、TNF-α（P<0.01）、IL-6（P<0.05）水平與HHcy組相比均有所下降。結論 葉酸、VB12可有效降低HHcy ApoE-/-小鼠血清TNF-α、IL-6的水平，緩解HHcy引起的血管損傷。

關鍵詞：葉酸；維生素B12；高同型半胱氨酸血癥；TNF-α；IL-6

動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）是血管內皮損傷后的一種緩慢而復雜的免疫炎癥性增生性疾病[1]，嚴重危害著人類健康。研究已經證實高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia， HHcy）是AS發病的獨立危險因素[2]。同型半胱氨酸（homocystein， Hcy）可通過對多種炎性因子和炎癥過程的影響促進AS的發生發展[3]。炎癥反應貫穿于AS起始、進展及斑塊破裂血栓形成的全過程，參與炎癥反應的細胞因子有TNF-α、IL-6等[4]。同屬維生素B族的葉酸和維生素B12（vitamin B12， VB12），是Hcy代謝途徑的重要決定因子，可以減少Hcy的生成[5]。本實驗擬以ApoE-/-小鼠為實驗對象，通過高蛋氨酸飲食復制ApoE-/-小鼠HHcy致AS動物模型，檢測葉酸和VB12干預治療后血清Hcy及TNF-α、IL-6的水平，探討葉酸和VB12抗AS機制。

1資料與方法

1.1一般資料 健康5周齡雄鼠（SPF級C57BL/6J）12只；健康5周齡雄性純合子ApoE-/-小鼠（SPF級近交系）36只（購自美國Jackson實驗室，由北京大學實驗動物中心提供）。

1.2實驗動物分組 各組小鼠性別、年齡均相匹配，適應環境1w后，分為四組：①正常對照組（n=12）：正常小鼠飼以普通飼料配方飲食，不包含膽固醇或動物油等任何高脂成分；②模型對照組（n=12）：ApoE-/-小鼠飼以普通飼料配方飲食，不包含膽固醇或動物油等任何高脂成分；③HHcy組（n=12）：ApoE-/-小鼠飼以高蛋氨酸飲食（普通飲食中加入1.7%蛋氨酸）；④干預組（n=12）：ApoE-/-小鼠飼以干預飲食（高蛋氨酸飲食同時加0.006%葉酸和0.0004%VB12）。小鼠喂養18w后處死，進行后續試驗。

1.3 ApoE-/-小鼠血清Hcy、TNF-α、IL-6含量檢測 小鼠眼球采血后，采用ELISA法檢測血清Hcy、TNF-α、IL-6水平。眼球取血，全血室溫自然凝固20min，2500rpm離心20min，取上清。設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；樣本孔先加待測樣本各10μL，再加樣本稀釋液40μL。標準品孔和樣本孔中每孔加入酶標抗體100μL，37℃恒溫箱溫育60min，棄去液體，拍干，每孔加1mL洗滌液，靜置1min，甩干，洗板5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值，并根據標準曲線計算Hcy、TNF-α、IL-6濃度。

1.4 統計學方法 數據以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05作為顯著界限。

2結果

2.1各組小鼠血清Hcy水平變化 與正常對照組比較，HHcy組Hcy濃度明顯升高，為正常對照組的2.29倍（P<0.01），是模型對照組的1.87倍（P<0.01），說明ApoE-/-小鼠HHcy模型復制成功；給予葉酸和VB12干預后，Hcy水平較HHcy組降低了27.99%，差異有顯著性（P<0.01），見圖1。

2.2各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平變化 ELISA檢測結果發現，HHcy組TNF-α、IL-6水平明顯高于正常對照組及模型對照組（P<0.01）；給予葉酸和VB12干預后，TNF-α、IL-6水平有所降低，差異有顯著性（P<0.01，P<0.05），見圖2、圖3。

3討論

AS是心腦血管疾病的重要基礎性病變，嚴重危害著人類的健康。有學者提出AS是具有慢性炎癥反應特征的病理過程，其發展始終伴隨炎癥反應。Hcy是一種含硫氨基酸，其作為甲硫氨酸代謝的中間產物參與了甲硫氨酸的關鍵環節[7]。葉酸和維生素VB12參與Hcy的代謝過程，可減少體內Hcy的產生[7]。臨床上當血液中Hcy濃度大于15mmol·L-1時即為HHcy，AS的風險明顯增加。HHcy致AS的機制復雜，目前尚未徹底清楚，有研究者認為炎癥反應可能為其主要機制之一[3]。TNF-α主要由激活的單核細胞、淋巴細胞分泌，是一種多功能的炎性細胞因子，參與炎癥、免疫反應，能夠促進AS的發展。IL-6是AS及其他心血管疾病重要的預測因子，IL-6水平的高低與疾病的預后及心血管事件的再發生緊密相關。

本研究發現，HHcy組小鼠Hcy水平明顯升高，經葉酸、VB12干預后，Hcy水平明顯下降，證實ApoE-/-鼠HHcy模型復制成功。HHcy組血清TNF-α、IL-6濃度明顯高于正常對照組與模型對照組，提示Hcy可能會通過增加TNF-α、IL-6的表達，加重炎癥反應，進而促進AS的發生發展；給予葉酸和VB12干預后，TNF-α、IL-6水平有所降低，提示葉酸、VB12可通過減少體內Hcy的產生，進而下調TNF-α、IL-6的水平，減輕炎癥反應。我們推測葉酸、VB12通過調整血清TNF-α、IL-6的水平而發揮其抗AS作用，但其具體信號傳導途徑尚需進一步研究，揭示其機制，尋求更好的治療方法，為臨床緩解及治療AS提供新的思路。

參考文獻：

[1]王露朝，李公信，劉芃，等.USPIO增強MR與Gd-DTPA增強MR在兔動脈粥樣硬化斑塊中的對比研究[J].實用醫學雜志，2014，3（5）：684-687.

[2]ZHOU J，AUSTIN RC. Contributions of hyperhomocysteinemia to atherosclerosis： Casual relationship and potential mechanisms[J]. Biofactors， 2009，35（2）：120-129.

[3]趙穎，李廣平.同型半胱氨酸對動脈粥樣硬化的炎癥促進作用[J].實用心腦肺血管病雜志，2006，14（6）：499-501.

[4]徐軍，齊法蓮，陳英劍，等.脂欣康膠囊對ApoE基因敲除小鼠血清炎癥細胞因子的影響[J]. 中國現代醫學雜志，2008，18（15）：2135-2137.

[5]TABAN-SHOMAL O， KILTER H， WAGNER A， et al. The cardiac effects of prolonged vitamin B12 and folate deficiency in rats[J]. Cardiovasc Toxicol， 2009，9（2）：95-102.

[6]Ross R. Atherosclerosis an inflammatory disease[J]. N Engl J Med， 1999，340（2）：115-119.

[7]楊安寧，王磊，周龍霞，等.ABCA1、ACAT1 DNA甲基化在Hcy致THP-1單核源性泡沫細胞膽固醇流出中作用機制研究[J].中國藥理學通報，2014，30（3）：340-344.

編輯/申磊