枇杷AmyrinSynthaseAS基因的5′RACE與3′RACE擴(kuò)增及序列分析

摘要 以‘解放鐘’枇杷（Eriobotrya japonica L.）葉片為材料，在前期獲得保守區(qū)的基礎(chǔ)上，采用RTPCR結(jié)合RACE技術(shù)，擴(kuò)增得到枇杷三萜合成途徑中關(guān)鍵酶香樹脂醇合成酶基因的5′和3′序列，并進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，AS基因5′非編碼區(qū)長(zhǎng)96 bp；3′非編碼區(qū)長(zhǎng)321 bp，在GenBank中更新的登錄號(hào)為JX173279.2，結(jié)合已發(fā)表保守區(qū)序列，通過拼接，得到AS基因全長(zhǎng)2 700 bp，含有一個(gè)2 283 bp的開放閱讀框，編碼760個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，該蛋白是定位于細(xì)胞核的蛋白，具有29個(gè)磷酸化位點(diǎn)，屬于ISOPREN_C2_like超家族，含有Camelliol C synthase、squalene/oxidosqualene cyclases、 Squalene cyclase多結(jié)構(gòu)域，與蘋果AS基因98%同源。

關(guān)鍵詞 枇杷；香樹脂醇合成酶基因；基因克隆；序列分析

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）25-08499-03

Abstract 5′cDNA and 3′cDNA of AS （Amyrin systhase Gene）， which was an important enzyme of terpenes synthesis were cloned with RTPCR and RACE from Eriobotrya japonica L. leaves on the basis of the gene conserved region we obtained. And then， the sequence was analyzed. The results showed that： the full length of ejAS mRNA （Updated GenBank accession number， JX173279.2）， about 1 775 bp， consisted of an Open Reading Frame of 1 239 bp， and 5' and 3' untranslated regions of 97 bp and 439 bp， respectively. The putative protein had 760 amino acids， and the identity to that of Malus domestica was 98%， and belonged to ISOPREN_C2_like super family， contained Camelliol C synthase， squalene/oxidosqualene cyclases， Squalene cyclase multiple domains.

Key words Eriobotrya japonica L.； Amyrin Synthase gene； Gene cloning； Sequence analys

枇杷（Eriobotrya japonica L.）是薔薇科枇杷屬常綠小喬木，原產(chǎn)我國，是兼具觀賞性、藥用和食用價(jià)值的植物種類[1]。枇杷的果實(shí)、花、葉、樹皮、根等含有多種有效生物活性組分，其中最重要的是五環(huán)三萜類化合物——熊果酸（ursolic acid，UA）、齊墩果酸（oleanolic acid，OA）、委陵菜酸（tormentic acid，TA）、科羅索酸（corosolic acid，CA）、山楂酸（maslinic acid，MA），它們擁有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)及大部分相同的生物合成途徑，可用于治療傷風(fēng)感冒、咳嗽、慢性支氣管炎、糖尿病、高血脂、癌癥等[2]，具有重要的商業(yè)價(jià)值，市場(chǎng)前景廣闊[3]。目前對(duì)植物中五環(huán)三萜化合物的生物合成途徑也有了一定的了解[4-5]，已發(fā)現(xiàn)的位于細(xì)胞質(zhì)中的PMD途徑以及位于質(zhì)體中的DXP途徑。

在藥用植物西洋參[6]、甘草[7]、歐洲山芥[8]等上已經(jīng)克隆得到mRNA全長(zhǎng)序列。利用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是目前中藥生產(chǎn)中極具潛力的技術(shù)路線[9-12]。另外，充分了解次生代謝產(chǎn)物的代謝途徑，利用基因克隆技術(shù)，基因啟動(dòng)子等關(guān)鍵調(diào)控因子分離克隆技術(shù)，繼而通過基因工程技術(shù)創(chuàng)造高產(chǎn)細(xì)胞系，成為生產(chǎn)植物次生代謝物最具潛力的研究領(lǐng)域[13-15]。通過植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)獲得的枇杷細(xì)胞培養(yǎng)物中含有豐富的五環(huán)三萜化合物，并經(jīng)過體外小鼠試驗(yàn)表明對(duì)糖尿病、高血脂有抑制作用[16-17]。筆者基于已獲得的枇杷香樹脂醇合成酶基因的保守區(qū)序列，進(jìn)一步進(jìn)行5′RACE與3′RACE擴(kuò)增，以期獲得完整的mRNA全長(zhǎng)序列，為正在進(jìn)行的枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)調(diào)控目標(biāo)產(chǎn)物五環(huán)三萜化合物含量的試驗(yàn)提供基因源。

1 材料與方法

1.1 材料

‘解放鐘’枇杷（Eriobotrya japonica L. cv.‘Jie Fang Zhong’）剛長(zhǎng)出的覆有絨毛、未見綠色、微卷的幼葉，于2011 年12 月采自福建省莆田縣果樹研究所。

1.2 方法

1.2.1 枇杷葉片RNA的提取。總RNA的提取采用北京天恩澤公司的柱式植物RNAOUT 2.0，參考試劑盒說明書提取。

1.2.5 序列分析及生物信息學(xué)分析。引物設(shè)計(jì)、序列及分析采用DNAMAN軟件，mRNA核酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列生物信息學(xué)分析采用ExPASy ProtParam，NCBICDS，PSORT TMHMM2.0 SignalP，Jpred，Coils，NetPhos 2.0，Gene Ontology annotation等在線軟件，具體參考李惠華等[18]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷AS基因的RACE擴(kuò)增結(jié)果

提取的枇杷葉片總RNA電泳顯示條帶清晰完整（圖1A），OD260/OD280=2.02，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

在已獲得的保守區(qū)[19]基礎(chǔ)上，以5′RACE的cDNA為模板，巢式PCR電泳結(jié)果顯示，經(jīng)2輪PCR之后擴(kuò)增出大小約900 bp的單一DNA片段（圖1C）。經(jīng)過測(cè)序、軟件分析，確認(rèn)此片段大小為888 bp，與保守區(qū)序列有272 bp的重疊片段（黑色區(qū)域見圖2），表明此片段是龍眼胚性愈傷組織AS的mRNA 5′端序列。

以3′RACE的cDNA為模板，巢式PCR電泳結(jié)果顯示，經(jīng)過2輪PCR后擴(kuò)增出與預(yù)期目標(biāo)片段相符約1 200 bp的單一條帶（圖1B），經(jīng)克隆測(cè)序以及結(jié)合保守區(qū)已有序列分析，與保守區(qū)序列有162 bp的重疊片段（灰色區(qū)域見圖2），確認(rèn)此片段大小為1 228 bp，是枇杷AS的mRNA 3′端序列。

將3′RACE和5′RACE的產(chǎn)物進(jìn)行序列拼接，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在2 700 bp左右得到單一條帶，且條帶清晰完整（圖1D）。陽性克隆送北京六合華大生物公司進(jìn)行測(cè)序。利用生物軟件DNAMAN5.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)得到枇杷AS基因全長(zhǎng)序列。該基因命名為ejAS基因，全長(zhǎng)2700bp，包含2 283個(gè)開放閱讀框，共編碼760個(gè)氨基酸，5′端非編碼區(qū)序列96 bp，3′端非編碼區(qū)序列321 bp，3′poly（A）尾長(zhǎng)18 bp。將該3′端序列和5′端序列在GenBank數(shù)據(jù)庫保守區(qū)登錄序列（登錄號(hào)為JX173279.1）中補(bǔ)充輸入，登錄號(hào)更新為JX173279.2。序列見圖2。

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