不同日糧氨基酸模型對吉林白鵝肌肉組織中MSTNmRNA表達量的影響

摘要 [目的]揭示肌肉生長抑制素與氨基酸營養的關系，為闡明鵝肌肉生長發育的調控機理提供依據。[方法] 利用分子生物學技術克隆吉林白鵝MSTN基因，通過飼喂4種不同的日糧氨基酸模型研究不同日糧氨基酸模型對1～28日齡和29～56日齡的吉林白鵝MSTN基因表達量的影響。[結果] 28 d，A組胸肌MSTN mRNA表達量極顯著高于其他3組（P<0.01）， A組和C組腿肌MSTN mRNA表達量顯著高于B和D組（P<0.05），在B組日糧氨基酸模型下胸肌和腿肌的 MSTN mRNA表達量與胸肌率和腿肌率呈極顯著負相關。56 d，A組和D組胸肌MSTN mRNA表達量顯著高于B組和C組（P<0.05），D組腿肌MSTN mRNA表達量顯著高于A、B、C組（P<0.05），在C組日糧氨基酸模型下胸肌和腿肌 MSTN mRNA表達量與胸肌率和腿肌率呈極顯著負相關。[結論] 28 d，日糧氨基酸模型B能夠抑制MSTN基因的表達，而56 d日糧氨基酸模型C能夠抑制MSTN基因的表達，并且MSTN基因表達量與胸肌率和腿肌率之間存在極顯著負相關。

關鍵詞 吉林白鵝；肌肉生長抑制素；日糧氨基酸模型；熒光定量PCR

中圖分類號 S835 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）25-08610-03

Abstract [Objective] The study aimed to reveal the relationship between MSTN and amino acid nutrition and provide basis for elucidating the regulation mechanism of the growth and development of muscles. [Method] MSTN gene of Jilin White Goose was cloned by using molecular biology techniques. The geese were fed with four different amino acid dietary models to study the effects of different amino acid dietary models on the expression amount of MSTN gene of 1-28 dayold and 29-56 dayold Jilin White Goose. [Result] On the 28dayold， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle in group A was extremely significantly higher than that in other three groups （P<0.01）. And the expression amount of MSTN mRNA in leg muscle in group A and C were significantly higher than that in group B and D （P<0.05） . In group B， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle and leg muscle showed extremely significantly negative correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate. On the 56dayold， the expression amount of MSTN mRNA in breast muscle in group A and D were significantly higher than that in group B and C （P<0.05）. The expression amount of MSTN mRNA in leg muscle in group D was significantly higher than that in other three groups （P<0.05）. In group C， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle and leg muscle showed extremely significantly negative correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate. [Conclusion] On the 28dayold， amino acid dietary model B could suppress the expression of MSTN gene. On the 56dayold， amino acid dietary model C could inhibit the expression of MSTN and the expression amount of MSTN showed significantly negatively correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate.

Key words Jilin White Goose； MSTN； Amino acid model； Fluorescence quantitative PCR

20世紀末，一個新的基因被國外學者從小鼠骨骼肌cDNA文庫中克隆出來，它不僅具有TGFβ超家族的典型結構，而且與該家族其他基因的同源性非常低，甚至已不屬于現存的亞家族，因此被歸類為新的類型：GDF8（Growth and differential factor8）[1]。因為其主要作用是抑制骨骼肌生長，所以被定名為肌肉生長抑制素（MSTN）[2]。MSTN基因對骨骼肌生長起到負調節作用，剔除此基因將導致部分缺失乃至單堿基突變，并且會引起MSTN mRNA表達量降低或者不表達，從而使骨骼肌變得更加發達，相應的脂肪會大幅度減少。更有一些研究者利用MSTN基因來調控家禽和家畜的肌肉生長[3-4]，因此MSTN基因是影響畜禽瘦肉率和改善肉質品質的重要營養基因。筆者探討鵝MSTN的基因與營養的深層次關系，結果發現MSTN基因表達量與生產性狀存在一些相關的聯系與規律，這對鵝的飼養和育種都具有實際的理論意義。筆者利用分子生物學技術克隆吉林白鵝MSTN基因，通過飼喂4種不同的日糧氨基酸模型，研究不同日糧氨基酸模型對1～28日齡和29～56日齡的吉林白鵝MSTN基因表達量的影響，以期揭示肌肉生長抑制素與氨基酸營養的潛在聯系和闡明鵝肌肉生長發育的調控機理。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗鵝選用1日齡健康吉林白鵝80只，分為4組，每組4個重復，每個重復5只。飼養至第28天和第56天，每個重復分別取身體發育相近的鵝2只，進行屠宰試驗。屠宰后采集鵝腿肌和胸肌肌肉組織，立即存于液氮罐中，并保存于-80 ℃超低溫冰箱。將鵝分割，使用電子天平上稱其全凈堂、胸肌和腿肌的重量，并計算胸肌率和腿肌率。

1.2 日糧組成及試驗設計

參照NRC（1994）家鵝飼養標準配置試驗日糧，1～28日齡和29～56日齡鵝的試驗日糧組成及營養水平見表1～4。根據鵝蛋白質氨基酸營養研究進展[5]，選取賴氨酸和蛋氨酸2個因素，采用2×2二因子試驗設計，以2個水平的賴氨酸和2個水平的蛋氨酸設計出4種氨基酸模型的日糧，為A、B、C和D。選取1～28日齡和29～56日齡2個時期，分別飼喂4種不同氨基酸水平的日糧。

1.3 主要試劑和儀器

總RNA提取試劑TRIZOL、Taq酶、回收試劑盒、克隆載體試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；Realtime PCR Master Mix購自TOYOBO公司；熒光定量PCR儀為ABI公司生產的STEPONE PLUS型號。

2 結果與分析

2.1 陽性質粒的PCR擴增鑒定和標準曲線的建立

以MSTN和bateactin基因重組質粒DNA作為模板，用MSTN和bateactin引物進行PCR擴增，可見130 bp和80 bp的條帶。該片段序列與NCBI網絡上公布的序列相同。MSTN cDNA的標準曲線為y=-3.361x+22.222，bateactin cDNA的標準曲線網絡為：y=-3.213x+20.476。其中，y表示Ct值，x表示模板量的對數值。Ct值和起始模板拷貝數表現出較強的相關性（MSTN：R2=0.997、bateactin：R2 =0.995）。

2.2 氨基酸模型對屠宰性能的影響

由表6可知，28日齡，A組吉林白鵝的胸肌率顯著低于其他3組（P<0.05），B組、C組和D組胸肌率差異不顯著（P>0.05），B組腿肌率顯著高于其他3組（P<0.05），A組、C組和D組之間腿肌率差異不顯著（P>0.05）。56日齡，C組吉林白鵝的胸肌率顯著高于其他3組（P<0.05），A組、B組和D組胸肌率差異不顯著（P>0.05），B組和C組腿肌率顯著高于A組和D組，B組與C組以及A組與D組之間腿肌率差異不顯著（P>0.05）。

2.3 氨基酸模型對不同肌肉組織MSTN mRNA表達量的影響

從表7可以看出，28日齡，A組胸肌MSTN mRNA表達量極顯著高于其他3組（P<0.01），而其他3組之間差異不顯著（P>0.05），A組和C組腿肌MSTN mRNA表達量顯著高于B組和D組（P<0.05），而A組與C組以及B組與D組之間差異不顯著（P>0.05）。56日齡，A組和D組胸肌MSTN mRNA表達量顯著高于B組和C組（P<0.05），而A組與D組以及B組與C組之間差異不顯著（P>0.05），D組腿肌MSTN mRNA表達量顯著高于A組、B組和C組（P<0.05），A、B、C 3組之間差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

MSTN是肌肉的負調控因子，屬于TGFβ超家族，其作為生命科學領域的研究熱點之一，現已引起醫學界、生物學家和育種學家的高度重視，肌肉生長抑制素甚至被研究者喻為能夠開啟大幅度提高畜禽肌肉生長和瘦肉率密碼的關鍵“鑰匙”[6-7]，作為影響動物生長和發育的主要因素，日糧營養與MSTN基因的表達有著必然的聯系，但現階段關于日糧營養水平以及氨基酸比例對動物肌肉中MSTN基因表達量影響的研究報道卻非常少，因此研究日糧氨基酸模型對動物MSTN基因表達的作用及其機制對采取綜合手段進行營養調控提高動物生產性能具有重要的指導意義。筆者研究了4組不同日糧氨基酸模型對28日齡和56日齡吉林白鵝胸肌和腿肌中MSTN表達量的影響，并對MSTN基因表達量和產肉率進行了相關性分析。研究發現，不同日糧氨基酸模型能顯著影響MSTN在胸肌和腿肌的表達量。28日齡，B組日糧氨基酸模型能夠抑制MSTN基因的表達量；56日齡，C組日糧氨基酸模型能夠抑制MSTN基因的表達量，并且MSTN基因表達量與胸肌率和腿肌率之間存在強負相關，這提示不同的日糧氨基酸對產肉率的影響可能是通過調節肌生成抑制素的表達量來實現的。胡俊鵬[8]等采用不同能量水平日糧對朗德鵝的研究表明日糧能量的高低對于22～70日齡鵝的生長和MSTN基因的表達有一定影響。呂文發等[9]研究發現MSTN基因表達量和產肉率之間存在著強負相關。湯青萍等[10]也發現鵝肌肉中MSTN基因表達量與肌肉增重情況恰恰相反。

參考文獻

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[3] SHARMA M，LANGLEY B，BASS J，et al.Myostatin in muscle growth and repair[J].Exercise and Sport ciences Reviews，2001，29（4）：155-158.

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[5] 李文立，王寶維，林英庭.飼糧不同蛋氨酸和賴氨酸水平對五龍鵝育成期生產性能及血漿尿酸和游離氨基酸濃度的影響[J].動物營養學報，2004，16（4）：33-38.

[6] 馬現永，施振旦，曹永長，等.雞、鵝肌肉生成抑制因子基因的克隆和序列分析[J].華南農業大學學報：自然科學版，2004，25（2）：85-88.

[7] MCPHERRON A C，LEE S J.Suppression of body fat accumulationin myostatindeficient mice [J].The Journal of Clinical Investigation，2002，109：595～601.

[8] 胡俊鵬.日糧能量對朗德鵝和溆浦鵝生長性能及肌肉生成抑制因子（MSTN）基因表達影響的研究[D].武漢：華中農業大學，2008.

[9] 呂文發，賀實偉，王軍，等.不同雜交組合與營養水平對牛肌肉中MSTN基因表達的影響[J].中國獸醫學報，2012，32（4）：624-627.

[10] 湯青萍，宋遲，章雙杰，等.不同鵝種 MSTN mRNA的表達特異性及其與體重的相關性分析[J].青島農業大學學報：自然科學版，2013，30（1）：29-33.