不同日糧氨基酸模型對(duì)吉林白鵝肌肉組織中MSTNmRNA表達(dá)量的影響

摘要 [目的]揭示肌肉生長(zhǎng)抑制素與氨基酸營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系，為闡明鵝肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)理提供依據(jù)。[方法] 利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆吉林白鵝MSTN基因，通過飼喂4種不同的日糧氨基酸模型研究不同日糧氨基酸模型對(duì)1～28日齡和29～56日齡的吉林白鵝MSTN基因表達(dá)量的影響。[結(jié)果] 28 d，A組胸肌MSTN mRNA表達(dá)量極顯著高于其他3組（P<0.01）， A組和C組腿肌MSTN mRNA表達(dá)量顯著高于B和D組（P<0.05），在B組日糧氨基酸模型下胸肌和腿肌的 MSTN mRNA表達(dá)量與胸肌率和腿肌率呈極顯著負(fù)相關(guān)。56 d，A組和D組胸肌MSTN mRNA表達(dá)量顯著高于B組和C組（P<0.05），D組腿肌MSTN mRNA表達(dá)量顯著高于A、B、C組（P<0.05），在C組日糧氨基酸模型下胸肌和腿肌 MSTN mRNA表達(dá)量與胸肌率和腿肌率呈極顯著負(fù)相關(guān)。[結(jié)論] 28 d，日糧氨基酸模型B能夠抑制MSTN基因的表達(dá)，而56 d日糧氨基酸模型C能夠抑制MSTN基因的表達(dá)，并且MSTN基因表達(dá)量與胸肌率和腿肌率之間存在極顯著負(fù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞 吉林白鵝；肌肉生長(zhǎng)抑制素；日糧氨基酸模型；熒光定量PCR

中圖分類號(hào) S835 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）25-08610-03

Abstract [Objective] The study aimed to reveal the relationship between MSTN and amino acid nutrition and provide basis for elucidating the regulation mechanism of the growth and development of muscles. [Method] MSTN gene of Jilin White Goose was cloned by using molecular biology techniques. The geese were fed with four different amino acid dietary models to study the effects of different amino acid dietary models on the expression amount of MSTN gene of 1-28 dayold and 29-56 dayold Jilin White Goose. [Result] On the 28dayold， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle in group A was extremely significantly higher than that in other three groups （P<0.01）. And the expression amount of MSTN mRNA in leg muscle in group A and C were significantly higher than that in group B and D （P<0.05） . In group B， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle and leg muscle showed extremely significantly negative correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate. On the 56dayold， the expression amount of MSTN mRNA in breast muscle in group A and D were significantly higher than that in group B and C （P<0.05）. The expression amount of MSTN mRNA in leg muscle in group D was significantly higher than that in other three groups （P<0.05）. In group C， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle and leg muscle showed extremely significantly negative correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate. [Conclusion] On the 28dayold， amino acid dietary model B could suppress the expression of MSTN gene. On the 56dayold， amino acid dietary model C could inhibit the expression of MSTN and the expression amount of MSTN showed significantly negatively correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate.

Key words Jilin White Goose； MSTN； Amino acid model； Fluorescence quantitative PCR

20世紀(jì)末，一個(gè)新的基因被國(guó)外學(xué)者從小鼠骨骼肌cDNA文庫中克隆出來，它不僅具有TGFβ超家族的典型結(jié)構(gòu)，而且與該家族其他基因的同源性非常低，甚至已不屬于現(xiàn)存的亞家族，因此被歸類為新的類型：GDF8（Growth and differential factor8）[1]。因?yàn)槠渲饕饔檬且种乒趋兰∩L(zhǎng)，所以被定名為肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）[2]。MSTN基因?qū)趋兰∩L(zhǎng)起到負(fù)調(diào)節(jié)作用，剔除此基因?qū)?dǎo)致部分缺失乃至單堿基突變，并且會(huì)引起MSTN mRNA表達(dá)量降低或者不表達(dá)，從而使骨骼肌變得更加發(fā)達(dá)，相應(yīng)的脂肪會(huì)大幅度減少。更有一些研究者利用MSTN基因來調(diào)控家禽和家畜的肌肉生長(zhǎng)[3-4]，因此MSTN基因是影響畜禽瘦肉率和改善肉質(zhì)品質(zhì)的重要營(yíng)養(yǎng)基因。筆者探討鵝MSTN的基因與營(yíng)養(yǎng)的深層次關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSTN基因表達(dá)量與生產(chǎn)性狀存在一些相關(guān)的聯(lián)系與規(guī)律，這對(duì)鵝的飼養(yǎng)和育種都具有實(shí)際的理論意義。筆者利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆吉林白鵝MSTN基因，通過飼喂4種不同的日糧氨基酸模型，研究不同日糧氨基酸模型對(duì)1～28日齡和29～56日齡的吉林白鵝MSTN基因表達(dá)量的影響，以期揭示肌肉生長(zhǎng)抑制素與氨基酸營(yíng)養(yǎng)的潛在聯(lián)系和闡明鵝肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)鵝選用1日齡健康吉林白鵝80只，分為4組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只。飼養(yǎng)至第28天和第56天，每個(gè)重復(fù)分別取身體發(fā)育相近的鵝2只，進(jìn)行屠宰試驗(yàn)。屠宰后采集鵝腿肌和胸肌肌肉組織，立即存于液氮罐中，并保存于-80 ℃超低溫冰箱。將鵝分割，使用電子天平上稱其全凈堂、胸肌和腿肌的重量，并計(jì)算胸肌率和腿肌率。

1.2 日糧組成及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照NRC（1994）家鵝飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配置試驗(yàn)日糧，1～28日齡和29～56日齡鵝的試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1～4。根據(jù)鵝蛋白質(zhì)氨基酸營(yíng)養(yǎng)研究進(jìn)展[5]，選取賴氨酸和蛋氨酸2個(gè)因素，采用2×2二因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以2個(gè)水平的賴氨酸和2個(gè)水平的蛋氨酸設(shè)計(jì)出4種氨基酸模型的日糧，為A、B、C和D。選取1～28日齡和29～56日齡2個(gè)時(shí)期，分別飼喂4種不同氨基酸水平的日糧。

1.3 主要試劑和儀器

總RNA提取試劑TRIZOL、Taq酶、回收試劑盒、克隆載體試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；Realtime PCR Master Mix購自TOYOBO公司；熒光定量PCR儀為ABI公司生產(chǎn)的STEPONE PLUS型號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增鑒定和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以MSTN和bateactin基因重組質(zhì)粒DNA作為模板，用MSTN和bateactin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可見130 bp和80 bp的條帶。該片段序列與NCBI網(wǎng)絡(luò)上公布的序列相同。MSTN cDNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.361x+22.222，bateactin cDNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線網(wǎng)絡(luò)為：y=-3.213x+20.476。其中，y表示Ct值，x表示模板量的對(duì)數(shù)值。Ct值和起始模板拷貝數(shù)表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性（MSTN：R2=0.997、bateactin：R2 =0.995）。

2.2 氨基酸模型對(duì)屠宰性能的影響

由表6可知，28日齡，A組吉林白鵝的胸肌率顯著低于其他3組（P<0.05），B組、C組和D組胸肌率差異不顯著（P>0.05），B組腿肌率顯著高于其他3組（P<0.05），A組、C組和D組之間腿肌率差異不顯著（P>0.05）。56日齡，C組吉林白鵝的胸肌率顯著高于其他3組（P<0.05），A組、B組和D組胸肌率差異不顯著（P>0.05），B組和C組腿肌率顯著高于A組和D組，B組與C組以及A組與D組之間腿肌率差異不顯著（P>0.05）。

2.3 氨基酸模型對(duì)不同肌肉組織MSTN mRNA表達(dá)量的影響

從表7可以看出，28日齡，A組胸肌MSTN mRNA表達(dá)量極顯著高于其他3組（P<0.01），而其他3組之間差異不顯著（P>0.05），A組和C組腿肌MSTN mRNA表達(dá)量顯著高于B組和D組（P<0.05），而A組與C組以及B組與D組之間差異不顯著（P>0.05）。56日齡，A組和D組胸肌MSTN mRNA表達(dá)量顯著高于B組和C組（P<0.05），而A組與D組以及B組與C組之間差異不顯著（P>0.05），D組腿肌MSTN mRNA表達(dá)量顯著高于A組、B組和C組（P<0.05），A、B、C 3組之間差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

MSTN是肌肉的負(fù)調(diào)控因子，屬于TGFβ超家族，其作為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，現(xiàn)已引起醫(yī)學(xué)界、生物學(xué)家和育種學(xué)家的高度重視，肌肉生長(zhǎng)抑制素甚至被研究者喻為能夠開啟大幅度提高畜禽肌肉生長(zhǎng)和瘦肉率密碼的關(guān)鍵“鑰匙”[6-7]，作為影響動(dòng)物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要因素，日糧營(yíng)養(yǎng)與MSTN基因的表達(dá)有著必然的聯(lián)系，但現(xiàn)階段關(guān)于日糧營(yíng)養(yǎng)水平以及氨基酸比例對(duì)動(dòng)物肌肉中MSTN基因表達(dá)量影響的研究報(bào)道卻非常少，因此研究日糧氨基酸模型對(duì)動(dòng)物MSTN基因表達(dá)的作用及其機(jī)制對(duì)采取綜合手段進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提高動(dòng)物生產(chǎn)性能具有重要的指導(dǎo)意義。筆者研究了4組不同日糧氨基酸模型對(duì)28日齡和56日齡吉林白鵝胸肌和腿肌中MSTN表達(dá)量的影響，并對(duì)MSTN基因表達(dá)量和產(chǎn)肉率進(jìn)行了相關(guān)性分析。研究發(fā)現(xiàn)，不同日糧氨基酸模型能顯著影響MSTN在胸肌和腿肌的表達(dá)量。28日齡，B組日糧氨基酸模型能夠抑制MSTN基因的表達(dá)量；56日齡，C組日糧氨基酸模型能夠抑制MSTN基因的表達(dá)量，并且MSTN基因表達(dá)量與胸肌率和腿肌率之間存在強(qiáng)負(fù)相關(guān)，這提示不同的日糧氨基酸對(duì)產(chǎn)肉率的影響可能是通過調(diào)節(jié)肌生成抑制素的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)的。胡俊鵬[8]等采用不同能量水平日糧對(duì)朗德鵝的研究表明日糧能量的高低對(duì)于22～70日齡鵝的生長(zhǎng)和MSTN基因的表達(dá)有一定影響。呂文發(fā)等[9]研究發(fā)現(xiàn)MSTN基因表達(dá)量和產(chǎn)肉率之間存在著強(qiáng)負(fù)相關(guān)。湯青萍等[10]也發(fā)現(xiàn)鵝肌肉中MSTN基因表達(dá)量與肌肉增重情況恰恰相反。

參考文獻(xiàn)

[1] MCPHERRON A C，LAWLER A M，LEE S J.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGFβ superfamilly member [J].Nature，1997，387：83-90.

[2] LEE C Y，HU S Y，GONG H Y，et al Suppression of myostatin with vector based RNA interference causes a double muscle effect in transgenic zebr afish[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，387：766-771.

[3] SHARMA M，LANGLEY B，BASS J，et al.Myostatin in muscle growth and repair[J].Exercise and Sport ciences Reviews，2001，29（4）：155-158.

[4] LEE S J，MCPHERRON A C.Myostatin and the control of skeletal muscle mass[J].Current Opinion in Genetics Development，1999，9：604-607.

[5] 李文立，王寶維，林英庭.飼糧不同蛋氨酸和賴氨酸水平對(duì)五龍鵝育成期生產(chǎn)性能及血漿尿酸和游離氨基酸濃度的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2004，16（4）：33-38.

[6] 馬現(xiàn)永，施振旦，曹永長(zhǎng)，等.雞、鵝肌肉生成抑制因子基因的克隆和序列分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，25（2）：85-88.

[7] MCPHERRON A C，LEE S J.Suppression of body fat accumulationin myostatindeficient mice [J].The Journal of Clinical Investigation，2002，109：595～601.

[8] 胡俊鵬.日糧能量對(duì)朗德鵝和溆浦鵝生長(zhǎng)性能及肌肉生成抑制因子（MSTN）基因表達(dá)影響的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[9] 呂文發(fā)，賀實(shí)偉，王軍，等.不同雜交組合與營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)牛肌肉中MSTN基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（4）：624-627.

[10] 湯青萍，宋遲，章雙杰，等.不同鵝種 MSTN mRNA的表達(dá)特異性及其與體重的相關(guān)性分析[J].青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，30（1）：29-33.