豬偽狂犬病毒湖北株gE基因的克隆與序列分析

摘要 [目的] 通過對從湖北省某豬場分離獲得的偽狂犬病毒的gE基因克隆和測序，分析其遺傳變化規律。[方法]參考GenBank中豬偽狂犬病病毒（Porcine pseudorabies Virus，PRV）gE基因的序列設計1對引物，對PRV湖北株gE基因進行PCR擴增和序列分析，PCR產物克隆到pMD 18T載體。對重組質粒進行限制性內切酶分析和基因測序，與GenBank收錄的國內外其他地區的標準參考毒株進行同源性分析和比較。[結果]與標準參考毒株的核苷酸序列同源性為95.0%～98.0%，進化樹分析表明，PRVHBXS2014株與河南焦作株EU561349China同屬于一個分支，親緣關系較近，但存在個別位點的基因突變。[結論] 為有效防控該病提供參考。

關鍵詞 豬偽狂犬病毒；gE基因；PCR擴增；克隆；序列分析

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）25-08502-02

Abstract [Objective] Based on cloning and sequencing of Hubei strain gE gene of porcine pseudorabies virus isolated from a pig farms in Hubei Province， their genetic variation was analyzed. [Method]A pairs of primers were designed and the sequence of gE gene of pseudorabies virus in the reference GenBank，PCR amplification and sequence analysis of PRV Hubei strain gE gene was done，and the PCR product was cloned into pMD 18T vector.By restriction enzyme analysis and sequencing of recombinant plasmid， homology analysis and comparison with the other regions included in GenBank standard reference strains at home and abroad.[Result]The results showed that with the standard reference strains， the nucleotide sequence homology of 95.0%-98.0%， phylogenetic tree analysis showed that，PRVHBXS2014 strain and Jiaozuo EU561349China in Henan strain belonged to the same branch， close relationship，but there are some gene mutation，and the results were consistent with the reported in the literature.[Conclusion] The study provided a reference for effective prevention and control of the disease.

Key words Porcine pseudorabies virus；gE gene；PCR amplification；Cloning；Sequence analysis

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（PRV）引起的多種家畜和野生動物均可感染的急性傳染病，以發熱、流產、死產、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎為主要癥狀，其中對豬的危害最大，且豬是唯一的自然宿主[1]。

PRV屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科，為雙鏈DNA，全長約150 kb，基因組GC含量最高達73%，包括70多個開放性閱讀框，可以編碼70～100種病毒蛋白。gE基因對PRV體內毒力表達、侵襲神經和沿著神經傳遞起著決定性的作用。目前gE缺失疫苗在病毒侵入神經系統方面被認為比其他單個非必需糖蛋白缺失苗更安全，同時gE不會影響病毒的復制和中和抗體的產生，且gE是所有野毒株均表達的一類糖蛋白。因此gE可作為PR凈化過程中標志基因，可區別感染動物和接種動物，以剔除陽性的野毒感染動物[2-3]。

2012年以來，我國許多省市暴發臨床癥狀疑似偽狂犬病的傳染病，尤其一些免疫過gE缺失疫苗的豬場也暴發該病，主要表現為豬群gE抗體陽性率顯著升高，母豬產弱仔、死胎，仔豬出現神經癥狀及死亡等，給我國的養豬業造成了巨大的經濟損失。筆者通過對從湖北省某豬場分離獲得的偽狂犬病毒的gE基因繼續克隆和測序，分析其遺傳變化規律，為有效防控該病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞 偽狂犬湖北株PRVHBXS2014株（武漢大學菌種庫保藏號：CCTCC V201420），BHK21細胞與大腸桿菌DH5α均為湖北省農業科學研究院動物胚胎工程分子育種湖北省重點實驗室凍存。

1.2 主要試劑 細胞培養基MEM和無菌小牛血清購自GIBCO公司；2×EasyTaq PCRMix購自全式金生物技術有限公司；限制性內切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ、pMD 18T載體及其連接試劑、DL2000 Marker購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖購自北京鼎國生物技術有限公司；膠回收試劑盒和DNA小提試劑盒購自愛思進生物技術有限公司。

1.3 病毒培養 將偽狂犬毒株用BHK21細胞培養，培養液為含10%小牛血清的MEM培養液，維持液為含2%小牛血清的MEN培養液。待細胞長至90%以上時加入適量病毒液，37 ℃吸附1 h，加入適量維持液，37 ℃培養，在細胞病變達到80%以上時停止培養，反復凍融3次后收獲病毒培養液。

1.4 引物的設計與合成 參考GenBank中已報道的豬偽狂犬病毒gE基因序列設計，上游引物P1：5’GCGGCCCTTTCTGCTGCG3’；下游引物P2：5’AGCGGGGCAGGACATCAA3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 DNA的提取 采用愛思進生物技術有限公司DNA小提試劑盒提取并于-20 ℃保存。

1.6 PCR擴增 PCR反應體系體積為50 μl，其中10 μmol/L上下引物各1 μl，DNA 模板5 μl，2×EasyTaq PCRMix 25 μl，剩下添加ddH2O至50 μl。反應程序：97 ℃ 10 min，72 ℃ 4 min；95 ℃ 1 min，65 ℃退火 2 min，72 ℃ 2.5 min，34個循環；72 ℃ 10 min。

1.7 PCR產物克隆和測序 PCR產物的克隆與鑒定連接反應體系為10 μl，依次加入PCR產物5 μl、pMD18T載體1 μl、連接緩沖液4 μl，16 ℃連接4 h。取5 μl連接產物轉化至制備好的DH5α感受態細胞，涂于含氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養 12～16 h。從平板上挑取單菌落接種于3 ml含氨芐青霉素的LB培養液，37 ℃振蕩培養16～20 h。提取質粒，用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切質粒后電泳，按分子量大小初步篩選陽性菌株，鑒定陽性重組質粒。將酶切鑒定為陽性的重組質粒送到上海生工生物工程有限公司測序，然后利用基因分析軟件DNAStar對測序結果進行分析比較。

2 結果與分析

2.1 gE基因的PCR擴增 以偽狂犬病毒湖北株DNA為模板，進行PCR擴增后得到1 626 bp的片段，與預期相符（圖1）。

2.2 重組質粒的酶切鑒定

提取重組質粒后選用限制性內切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，獲得2條大小為2 692和1 626 bp左右的片段，分別與預期基因片段大小相符（圖2）。

2.3 gE基因的序列測定及其分析 利用DNAStar軟件將測出的HBXS2014gE基因全序列（圖3）與國內外報道的PRV分離株（AY183124、湖北Ea株AF171937、廣東SH株EF552427、AF207700、美國Becker株AY368490、FJ605135、JF460026、JX417716、Fa株AF403049、河南焦作株EU561349China、Malaysia株FJ176390、GZZ1株HQ832846、西班牙NiA3株EU502923、Rice株M14336、MINA株AY170318）進行核苷酸同源性比較分析。

3 討論

近年來，豬偽狂犬病席卷全國大部分省份，臨床病例呈逐漸上升趨勢。目前表現為臨床癥狀不明顯，仔豬少見神經癥狀，母豬主要表現為流產和死胎，發病出現急性死亡，犬貓大量死亡；免疫不同廠家不同毒株疫苗依然發病；臨床抗體檢測免疫效果好的豬場依然發病；豬偽狂犬病毒野毒的感染率在70%～80%。目前已給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。

該研究通過PCR技術成功克隆出了PRVHBXS2014株的gE基因，序列全長為1 626 bp，通過與國內外已公布序列對比發現，該毒株與EU561349China株同源性最高，同屬于一個分支，通過核苷酸序列對比發現存在一定的基因突變現象。

參考文獻

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