11種殺蟲劑對松墨天牛延伸因子2（EF—2）基因表達的影響

摘要[目的]研究殺蟲劑對松墨天牛延伸因子2（MaEF2）的影響，為深入研究MaEF2的功能、利用延伸因子基因靶標有效防治松墨天牛提供參考。[方法]從松墨天牛文庫中分離得到EF2cDNA序列，利用RTqPCR技術測定了11種殺蟲劑脅迫后MaEF2的相對表達量。[結果]得到的MaEF2基因的部分序列，長度為1 184 bp，編碼287個氨基酸；與黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）和家蠶（Bombyx mori）氨基酸相似性分別為92% 和93%。RTqPCR測定結果表明，殺蟲劑作用下MaEF2均上調表達，表達量為對照的1.28～11.59倍。[結論]啶蟲脒的相對表達量最高，毒死蜱和噻蟲啉的表達量最低，這可能表明松墨天牛產生了自我保護反應。

關鍵詞松墨天牛；殺蟲劑；延伸因子2；RTqPCR

中圖分類號S763.38文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）24-08112-04

The Expression of the Elongation Factor 2 Gene from Monochamus alternatus in Response to 11 Kinds of Insecticide

LUO Linlin， LIN Tong（College of Forestry， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510225）

Abstract [Objective] This study provides molecular data for the influence of insecticides on M. alternatus EF2， and the reference for the further research on the functions of M. alternatus EF2 which can be a target against M. alternatus. [Method] A partial cDNA sequence of elongation factor 2 gene from M. alternatus library was isolated and named MaEF2， and the relative expression of MaEF2 in response to 11 kinds of insecticides was determined by RTqPCR. [Result] The results showed that MaEF2 is 1184bp in length which has 92% and 93% amino acid similarity with the EF2 of Drosophila melanogaster and Bombyx mori， respectively.MaEF2 were up regulated under pesticides stress， and the expression level was changed from 1.28 times to 11.59 times as that as the control. [Conclusion] The expression of acetamiprid was the highest， the expression of thiacloprid and chlorpyrifos was the lowest， all of which showed that M. alternatus produced a selfprotective reaction to the insecticides.

Key words Monochamus alternatus Hope； Pesticides； EF2； Real time quantitative PCR

延伸因子（elongation factor，EF）是參與蛋白合成過程中肽鏈延伸的蛋白因子，在所有多細胞生物體的新陳代謝過程中發揮著非常重要的作用，它包括延伸因子 EF1 和延伸因子 EF2[1-3]。延伸因子 EF1 由 α、β、γ 和 δ 4個亞基組成，是細胞內普遍存在且大量表達的多聚核糖體蛋白質，在基因表達和翻譯過程中起重要作用[4]。EF2 是真核生物蛋白質合成時肽鏈延伸過程中必不可少的蛋白因子[5]，它能催化GTP 水解，使肽酰-tRNA 從核糖體的氨酰基位點（aminoacyl site，A-site）移到肽基位點（peptidyl site，Psite），從而使核糖體沿著 mRNA 運動以完成轉錄過程[6]。因此，EF2 的正常表達關系到機體細胞的生長及蛋白質的合成。EF2 通過不斷改變其在細胞內的表達量，以調節總蛋白質的合成[7]，同時，在不同機制作用下，EF2 的活性和表達量也會發生改變[8]。研究表明在甲殼動物養殖生產中，水體環境中的應激因素（pH、重金屬等）可以引起廣泛的細胞損傷，包括 DNA 損害、脂質過氧化作用以及蛋白質氧化等[9]，最終導致 EF2 的表達量發生變化。

松墨天牛（Monochamus alternatus）是為害馬尾松（Pinus massoniana）等林木的重大森林害蟲，成蟲又是松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）的主要傳播媒介，因其為害嚴重且防治困難已被世界上許多國家列入檢疫對象[10]。

筆者首次克隆了松墨天牛延伸因子 EF2 基因并分析該基因在11種殺蟲劑作用后的相對表達含量，旨在了解松墨天牛延伸因子 EF2基因的結構以及該基因在不同類型殺蟲劑作用下的反應，為今后進一步研究松墨天牛 EF2 的功能和與殺蟲劑之間的作用機制提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試昆蟲松墨天牛幼蟲采自從化馬尾松次生林，室內配置人工飼料，在人工氣候箱中培養，設置環境條件為：25 ℃，相對濕度70%～75%，黑暗條件，飼養至蛻變為成蟲[11]。

1.2主要試劑Trizol總RNA抽提試劑盒購自OMEGA生物有限公司；PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM購自大連寶生物工程有限公司；DNA分子量標準1kp DNA Ladder購自天根生化科技有限公司。

1.3基因克隆和序列比對構建了松墨天牛cDNA文庫，從中分離得到松墨天牛EF2基因。用GenBank的BLASTN和BLASTP在線工具進行松墨天牛EF2及其他昆蟲EF2核酸序列的相似性分析；用DNAMAN軟件進行多序列比對分析。

1.4殺蟲劑處理用6種化學殺蟲劑和5種微生物殺蟲劑處理松墨天牛成蟲，殺蟲劑信息見表1。每種處理3個重復，每個重復3頭試蟲，受藥12 h后用液氮速凍，于-80 ℃保存備用。

1.5總RNA提取與cDNA合成用Trizol總RNA抽提試劑盒提取殺蟲劑處理后松墨天牛總RNA，純化后，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用微量紫外分光光度儀 （Nanodrop 2000） 檢測其濃度，置于-80 ℃保存備用。參照反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser說明書，獲得第一鏈cDNA，作為RTqPCR的反應模板，置于-20 ℃保存備用。

1.6RTqPCR檢測以EF2在成蟲（未經藥劑處理）中的表達量為標準參量，以微管蛋白（βactin）基因為內參基因，無菌超純水為陰性對照，采用RTqPCR（SYBR Green）檢測MaEF2在殺蟲劑脅迫后的相對表達量。RTqPCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，進行40個循環。熒光定量PCR儀為羅氏LC480，設cDNA樣品3次重復，反應結束后采集目標基因和內參基因的 Ct值，利用 2-ΔΔCT相對定量法計算相對表達量[12]。

安徽農業科學2014年1.7數據分析采用DPS軟件中的Duncan方法對RTPCR數據進行顯著性方差分析。

表1農藥規格及稀釋濃度

藥劑名稱生產廠家稀釋倍數處理方法5%啶蟲脒乳油佛山市大興生物化工公司900倍液噴霧18%殺蟲雙水劑中山凱中公司700倍液噴霧2.5%敵殺死拜耳作物科學公司4 000倍液噴霧24%滅多威可溶性液劑江門市大光明農化新會公司240倍液噴霧48%毒死蜱乳油江蘇蘇州佳輝化工公司1 600倍液噴霧5% 氯氰菊酯乳油鄒平縣綠大藥業公司1 500倍液噴霧40%噻蟲啉懸浮劑利民化工股份公司2 000倍液噴霧0.3%印楝素乳油海南利特蒙生物農藥公司800倍液噴霧100億活芽孢/ml BT懸浮劑太原高新技術產業西芮生物公司200倍液口腔注射200億活孢子/g綠僵菌粉劑廈門多多生物公司1×108個/ul浸泡10 s400億個孢子/g白僵菌粉劑江西天人生態公司1×108個/ul浸泡10 s對照-清水噴霧

2結果與分析

2.1MaEF2 序列從松墨天牛基因文庫中獲得EF2 基因的 cDNA，長度為1 184 bp，編碼287個氨基酸，命名為MaEF2，核苷酸序3小結與討論

真核生物的延伸因子2是一種質量為100 000 Da的單體多肽，通過催化依賴于GTP水解的轉位反應將A位生成的肽基-tRNA轉移到P位，原來P位上空載的tRNA被逐出核糖體，同時，核糖體沿著mRNA向前移動一個密碼子[6，13]。目前，已分離獲得果蠅、老鼠和倉鼠、甲烷球菌以及小球藻等真核生物的EF2基因[14]，松墨天牛EF2的克隆是首次報道。

EF2 蛋白的主要結構在進化過程中非常保守，經GenBank數據庫BLASTN、BLASTX比對表明，推導的 MaEF2 氨基酸序列與其他已知昆蟲 EF2 氨基酸序列有 84%～94%的同源性。筆者克隆出的MaEF2基因長度為1 184 bp，編碼287個氨基酸，但根據其他昆蟲EF2基因全長序列分析，獲得的MaEF2可能只是EF2基因全長的部分序列，還缺少3’端約1 kbp的氨基酸序列，但這不影響分析該基因的表達。后期，將進行MaEF2全長基因的克隆，以深入了解松墨天牛EF2的結構和功能。

該研究檢測了經殺蟲劑脅迫后，EF2 mRNA在松墨天牛成蟲中的表達情況，結果顯示該基因在啶蟲脒作用后的相對表達量最高，為空白對照表達量的11.59倍，其次是殺蟲雙，為8.02倍，綠僵菌和白僵菌的脅迫作用無顯著差異，毒死蜱和滅多威的作用效果較弱。不同殺蟲劑作用于MaEF2基因，導致其均有不同程度的上調表達，這可能是松墨天牛產生的自我保護反應。生物有機體細胞適應環境壓力的能力是它們生存的關鍵，生物體在進化過程中使其對環境和生理壓力具有一定的應答能力[1]，然而許多應答的共同特點是選擇性調節基因的轉錄和翻譯，包括允許可逆基因的快速表達[15-16]。目前研究表明環境壓力可誘導 EF2 基因的表達，從而調節蛋白質合成以應對環境條件的變化[17-18]。WANG等[1]研究了凡納濱對蝦EF2 基因在肝胰腺中的相對表達量，結果顯示，EF2 基因在酸性條件處理下隨著時間的延長呈現先增加后降低再增加的表達趨勢；在堿性條件處理下，結果同樣是呈現先增加后降低再增加的表達趨勢。在環境條件變化下，包括在殺蟲劑作用下松墨天牛 EF2 基因的具體功能和作用機制還需進一步研究。

參考文獻

[1] WANG L，LIU Y，WANG W N，et al.Molecular characterization and expression analysis of elongation factors 1A and 2 from the Pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei[J].Molecular Biology Reports，2011，38（3）：2167-2178.

[2] NILSSON J，NISSEN P.Elongation factors on the ribosome[J].Current Opinion in Structural Biology，2005，15（3）：349-354.

[3] PROUD C G.Peptide-chain elongation in eukaryotes[J].Molecular Biology Reports，1994，19（3）：161-170.

[4] ANDERSEN G R，NISSEN P，NYBORG J.Elongation factors in protein biosynthesis[J].Trends in Biochemical Sciences，2003，28（8）：434-441.

[5] WEISSBACH H，OCHOA S.Soluble factors required for eukaryotic protein synthesis[J].Annual Review of Biochemistry，1976，45（1）：191-216.

[6] KOHNO K，UCHIDA T，OHKUBO H，et al.Amino acid sequence of mammalian elongation factor 2 deduced from the cDNA sequence：Homology with GTP-binding proteins[J].Biochemistry，1986，83（14）：4978-4982.

[7] EUN J L，KIM C W.Functional characterization of the promoter region of the chicken elongation factor-2 gene[J].Gene，2007，386（1）：183-190.

[8] MALAVE T M，FORNEY J D.Identification of a developmentally regulated translation elongation factor 2 in Tetrahymena thermophila[J].Gene，2004，326（1）：97-105.

[9] FIGUEIREDOPEREIRA M E，YAKUSHIN S，COHEN G.Accumulation of ubiquitinated proteins in mouse neuronal cells induced by oxidative stress[J].Molecular Biology Reports，1997，24（1）：35-38.

[10] 羅淋淋，韋春梅，林同.松墨天牛分子生物學研究進展[J].中國森林病蟲，2014，33（1）：24-28.

[11] 徐金華，黃秀鳳，徐華潮，等.松墨天牛室內人工飼養及其生物學特性觀察[J].浙江林業科技，2009，29（4）：86-88.

[12] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[13] GRINBLAT Y，BROWN N H，KAFATOS F C.Isolation and characterization of the DrosoPhila translation elongation factor 2 gene[J].Nucleic Acids Research，1989，17（18）：7301-7314.