乳酸乳球工程菌表達L—苯丙氨酸解氨酶的工藝優化

摘要[目的]提高乳酸乳球工程菌表達L苯丙氨酸解氨酶的水平。[方法]對培養基種類、接種量、培養溫度、誘導劑濃度、磷酸甘油二鈉濃度等因素進行了優化。[結果]使用DifcoTM M17 Broth培養基培養乳酸乳球菌時，L苯丙氨酸解氨酶表達活性最高；磷酸甘油二鈉對L苯丙氨酸解氨酶表達活性有較大影響，可提高活性93.8%。通過正交試驗，得到PAL最佳表達條件為接種量2.0%，培養溫度30 ℃，磷酸甘油二鈉濃度2.0%，誘導劑濃度10.0 μg/L。PAL表達酶活可達3.05 IU/ml。[結論] 在發酵擴大培養中優化了L苯丙氨酸解氨酶在乳酸乳球菌中的表達條件，為今后生產及應用提供參考。

關鍵詞乳酸乳球菌； L苯丙氨酸解氨酶； 工藝優化

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）24-08092-03

Process Optimization of L phenylalanine Ammonialyase Expression in Lactococcus lactis

HUANG Letian et al（Guangzhou Institute of Microbiology，Guangzhou，Guangdong 510000）

Abstract[Objective ]In order to improve the level of L phenylalanine ammonialyase expression in Lactococcus lactis. [Method]The kinds of culture medium， inoculum concentration， incubation temperature， inducer concentration， two sodium glycerophosphate concentration were optimized。[Results] The cultured L.lactis medium using DifcoTM M17 Broth， L phenylalanine ammonia lyase activity is highest； two sodium glycerophosphate on L phenylalanine ammonialyase expression significantly affected the enzyme activity， can improve the activity of 938%. Through the orthogonal experiment， the optimal conditions for PAL expression were inoculum concentration 2.0%， incubation temperature 30 ℃， two sodium glycerophosphate concentration 2.0%， inducer concentration 10.0 μg/L. The expression of PAL enzyme activity was 3.05 IU/ml. [Conclusion] The study optimized expression condition of L phenylalanine ammonialyase in Lactococcus lacti， and provided a reference for future production and application.

Key wordsLactococcus lactis；L phenylalanine ammonialyase；Process optimization

乳酸乳球菌是一種同型發酵的革蘭陽性菌，是公認安全的食品級微生物，對人畜無害，長期以來被廣泛應用于各類乳制品發酵和生產中。近年來乳酸乳球工程菌的研究日益受到重視，目前其全基因組測序工作已完成，隨著一些內部調控元件的發現，相繼開發出一系列克隆、表達和整合載體，促進了乳酸乳球菌在分子生物學方面的大力發展，其中以NICE為代表的食品級誘導表達系統成為現今研究的熱點[1]。

乳酸乳球菌表達系統比其他表達系統更具有優勢，利用乳酸乳球菌能夠直接到達腸道，進而誘導表達。乳酸乳球菌已經被開發出來用于表達細菌和病毒的抗原基因，并產生了有效免疫應答，被認為是一種理想的表達載體。陳思維等[2]將人胰島素基因在乳酸菌中表達并考察其對非肥胖糖尿病小鼠的作用，為實現人胰島素基因在乳酸菌中的表達及探索其用作口服疫苗治療Ⅰ型糖尿病的可行性。龔芳紅等[3]構建含幽門螺桿菌（Helibacter pylori）熱休克蛋白A編碼基因的重組載體，并轉入乳酸乳球菌，表達目的蛋白并分析其免疫原性，為幽門螺桿菌基因工程口服疫苗的研究和開發奠定基礎。

L苯丙氨酸解氨酶是催化脫掉L苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。人體內苯丙氨酸濃度超標會引起苯丙酮尿癥，通過L苯丙氨酸解氨酶的催化作用，可降低苯丙氨酸濃度，達到治療效果。筆者對已構建的含L苯丙氨酸解氨酶基因的乳酸乳球工程菌進行發酵擴大培養，通過優化培養條件及誘導條件，探尋其最佳表達工藝，為將來實際應用提供參考價值。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌。乳酸乳球工程菌由廣州市微生物研究所提供。

2結果與分析

2.1不同培養基對PAL表達的影響選用MRS培養基、改良型M17培養基、DifcoTM M17 Broth培養基作為試驗培養基，考察了這幾種培養基對PAL表達效果的影響。MRS培養基是乳酸菌最普遍使用的培養基，工業上應用較多。DifcoTM M17 Broth培養基與改良型M17培養基的主要區別是前者含有磷酸甘油二鈉，而后者含有磷酸氫二鈉和甘油。各培養基對PAL表達的影響結果見圖1。由圖1可知，PAL在DifcoTM M17 Broth培養基中的表達效果最佳，分別比MRS培養基、改良型M17培養基高62%和24%，DifcoTM M17 Broth培養基的效果好可能是因其含有磷酸甘油二鈉。盡管DifcoTM M17 Broth表達效果好，但其成本較貴，綜合考慮宜選用MRS培養基或改良型M17培養基。

圖1不同培養基對PAL表達的影響2.2不同接種量對PAL表達的影響選用接種量分別為0.5%、2.0%、5.0%、10.0%，各接種量對PAL表達的影響見圖2。由圖2可知，當接種量為2.0%時PAL的表達效果最好。接種量過小會延長培養時間，增加傳代次數，影響細胞生成量；接種量過大會影響產物合成，且過多移入代謝產物，不利于PAL表達。

圖2不同接種量對PAL表達的影響2.3不同培養溫度對PAL表達的影響由圖3可知，隨著溫度的升高，PAL的表達量先上升后下降，可能前期溫度的升高有利于細胞的生長繁殖，而高溫不利于誘導劑的誘導，導致表達量下降。PAL在30、35 ℃環境下的表達效果最好，考慮到成本因素，最佳表達溫度為30 ℃。

圖3不同培養溫度對PAL表達的影響2.4不同磷酸甘油二鈉濃度對PAL表達的影響改良型M17培養基用磷酸氫二鈉和甘油代替磷酸甘油二鈉，結果其PAL表達效果比DifcoTM M17 Broth培養基差，所以磷酸甘油二鈉對PAL的表達有一定的影響。不同磷酸甘油二鈉濃度條件下PAL的表達情況見圖4。由圖4可知，隨著磷酸甘油二鈉濃度的增加，PAL的表達活性也相應的遞增，當濃度達到一定值時，PAL表達量趨于穩定。當磷酸甘油二鈉濃度為2.0%時，表達效價為2.52 IU/ml，比不使用磷酸甘油二鈉的效價高93.8% 。

圖4不同磷酸甘油二鈉濃度對PAL表達的影響2.5不同誘導劑Nisin濃度對PAL表達的影響由圖5可知，當Nisin濃度為0時，PAL沒有表達，其酶活為0，表明PAL的表達受Nisin控制。Nisin濃度從0增加到10.0 μg/L時，酶活呈上升趨勢，當Nisin濃度在5.0～10.0 μg/L時，酶活達最高，此階段PAL表達與Nisin濃度呈正向關系。之后隨著Nisin濃度的繼續增加，PAL的表達量反而下降，Nisin濃度高于400 μg/L后，酶活急劇下降，Nisin濃度為800 μg/L時，基本沒有表達。其原因可能是，Nisin作為一種乳鏈菌肽，具有天然防腐、抑菌作用，當Nisin濃度過高會對乳酸乳球菌產生抑制作用。因此，Nisin的最佳誘導濃度為100 μg/L。

安徽農業科學2014年3結論與討論

乳酸乳球菌是一種常用益生菌，主要功效是改善腸道功能，提高機體免疫力。目前乳酸乳球菌也是最常用的誘導表達型宿主菌，具有重要的經濟價值。該研究對L苯丙氨酸解氨酶在乳酸乳球工程菌內的表達條件進行優化，旨在利用乳酸乳球菌食品級誘導表達系統表達與疾病相關的免疫因子和抗原，從而為預防和治療疾病提供新途徑。該試驗考察了培養基種類、接種量、培養溫度、磷酸甘油二鈉濃度、誘導劑濃度等對PAL表達的影響，其中誘導劑Nisin的影響作用最大，最佳表達條件是接種量20%，培養溫度30 ℃，磷酸甘油二鈉濃度為20%，Nisin濃度為100 μg/L。賈興元等[4]將人工合成苯丙氨酸脫氨酶基因在乳酸乳球菌中克隆并進行食品級表達，以期進一步用于治療苯丙酮尿癥的研究，該試驗在發酵擴大培養中優化了L苯丙氨酸解氨酶在乳酸乳球菌中的表達條件，為今后生產及應用提供參考依據。

參考文獻

[1] 李芳，李永明，徐子偉，等.乳酸乳球菌作為基因工程受體菌研究進展[J].生物技術通報，2010（5）：61-64，81.

[2] 陳思維，鐘瑾，還連棟.人胰島素基因在乳酸菌中的表達及其對非肥胖糖尿病（NOD）小鼠的作用[J].微生物學報，2007（6）：987-991.

[3] 龔芳紅，賀松，張德純，等.幽門螺桿菌熱休克蛋白A在乳酸乳球菌中的表達及免疫學活性分析[J].中國微生態學雜志，2010（2）：106-109.

[4] 賈興元，陳星，蘇暢，等.人工合成苯丙氨酸脫氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品級表達[J].中華微生物學和免疫學雜志，2006（1）：23-26.