大黃和公丁香對致病性哈氏弧菌及其生物膜的體外抑制作用

摘要[目的]觀察大黃（Rheum officinale）和公丁香（Flos caryophylli）對哈氏弧菌（Vibrio harveyi）及其生物膜（Biofilm）的體外抑制作用。[方法]采用瓊脂擴散法測定大黃和公丁香對哈氏弧菌的體外抑菌作用；采用倍比稀釋法測定大黃和公丁香對哈氏弧菌最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）；中圖分類號S941.43文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）24-08188-03

The Inhibitory Activity of Flos caryophylli and Rheum officinale on Vibrio harveyi and Its Biofilm

LI Jiaqin， PANG Huanying et al（Fisheries College of Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524088； Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals， Zhanjiang， Guangdong 524088； Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions， Zhanjiang， Guangdong 524088）

Abstract[Objective] To observe the inhibitory effects of Rheum officinale and Flos caryophylli on Vibrio harveyi and its biofilm. [Method] The inhibitory effects of Rheum officinale and Flos caryophylli on Vibrio harveyi were tested by disc agar diffusion， and the MIC and MBC were detected by the double dilution； the effects of Rheum officinale and Flos caryophylli on the formation of Vibrio harveyi biofilm were measured by MTT assay. [Result] Rheum officinale had inhibitory effects with the diameter of inhibition zone （DIZ） of （15.31±0.4） mm， and the MIC and MBC were 7.183 mg/ml； Flos caryophylli had inhibition effects with DIZ of （11.53±0.6） mm， and the MIC and MBC were 15.625 mg/ml， 62.5 mg/ml. Both Rheum officinale and Flos caryophylli exhibited a potent inhibitory activity against Vibrio harveyi biofilm formation （P<0.01）. [Conclusion] Rheum officinale and Flos caryophylli could significantly inhibit Vibrio harveyi and its biofilm.

Key wordsRheum officinalekl； Flos caryophylli； Vibrio harveyi； Biofilm； In vitro inhibitory activity

哈氏弧菌（Vibrio harveyi）隸屬弧菌科（Vibrionaceae）弧菌屬（Vibrio），是一種革蘭氏陰性、發光海洋細菌，廣泛分布于海洋環境中[1]，是危害水產養殖動物的重要致病菌之一。該菌能夠感染中國對蝦（Penaeus chinensis）[2]、文蛤（Meretrix meretrix ）[3]和大黃魚（Pseudosciaena crocea）[4]等多種海水養殖動物，給水產養殖業造成巨大的經濟損失。哈氏弧菌在水體中主要以生物膜（Biofilm）的形式生存。生物膜是細菌聚集粘結在一起分泌的黏性物質，其主要成分為多糖、核酸、脂類和蛋白等[5]。生物膜能保護細菌對抗外界危險，增強其對抗菌藥物的耐受能力[6]。目前，水產養殖中主要采用抗生素等化學藥物防治弧菌病，但抗生素的長期使用會使病原產生耐藥性，會嚴重破壞養殖水域的生態環境，并且對人體健康構成潛在的威脅[7]。因此，尋找安全有效的抗菌藥物是目前研究的熱點之一。

中草藥是我國醫學寶庫中最珍貴的財富之一，含有很多抗菌活性強、毒性低的有效成分。大黃和公丁香是常用的中草藥，它們在防治水產動物疾病中有著廣泛的應用。曹紅峰等[8]證實大黃對致病性弧菌、魚害粘球菌（Myxococcuspiscolasp.nov.）和假單胞菌（Pseudomonadaceae）等常見水產動物的病原菌有明顯的抑制作用。王玉娥等[9]證實哈氏弧菌對大黃和公丁香具有較高的敏感性。但是，關于這2種中藥對哈氏弧菌生物膜生成的抑制作用尚未見報道。筆者通過測定大黃和公丁香對哈氏弧菌及其生物膜的體外抑制作用，探索這2種中藥的抑菌作用和抗生物膜功能，以期為今后應用中藥防治由該菌引起的弧菌病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和中草藥。哈氏弧菌HY99由廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室分離鑒定并保存。大黃和公丁香購自湛江春天藥房。

1.1.2試驗儀器。SZ93自動雙重雙蒸水蒸餾水器，購自上海市亞榮生化儀器廠；自動高壓滅菌鍋（HVE50），購自日本HIRAYAMA公司；恒溫培養箱，購自上海市博迅實業有限公司醫療設備廠；超凈工作臺，購自濟南鑫貝西生物技術有限公司；搖床，由上海博迅實業有限公司醫療設備廠生產；酶標儀，購自美國BioRad公司。

1.1.3主要試劑。MTT（Sigma公司）；結晶紫、冰醋酸、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、NaClDMSO（二甲基亞砜）均為國產分析純。

1.1.4主要溶液和試劑的配制。①TSB液體培養基：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g以及NaCl 20 g，蒸餾水定容至1 000 ml（調節pH至7.2），高壓滅菌，4 ℃保存。②TSA固體培養基：TSB液體培養基（瓊脂粉濃度1.5%），高壓滅菌后，無菌條件下倒平板，凝固冷卻后4 ℃保存。③0.1%結晶紫染液：溶液A，結晶紫0.2 g、95%酒精20 ml；溶液B，草酸銨0.8 g、蒸餾水80 ml。將A、B溶液混合，濾紙過濾后短期使用。④0.85%生理鹽水：稱取NaCl 0.85 g，用蒸餾水定容至1 000 ml，高壓滅菌后備用。⑤MTT 配制：稱取MTT 0.5 g，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS），用0.22 μm濾膜過濾除菌，置于4 ℃避光保存備用。⑥PBS緩沖液：A：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 1.44 g；B：磷酸二氫鉀（KH2PO4） 0.24 g，調節pH至7.4，定容1 L，高壓蒸汽滅菌，室溫保存。⑦33%乙酸溶液：量取33 ml冰醋酸，用蒸餾水定溶至100 ml，搖勻備用。

1.2方法

1.2.1哈氏弧菌的培養。將菌株接種在含2%NaCl的TSB中，28 ℃，180 r/min搖床培養18 h。用無菌TSB將菌懸液調節OD600nm約0.7備用。

1.2.2中草藥水煎液的制備。大黃資源豐富，價格低廉，并且對哈氏弧菌及其生物膜體外抑制效果較好，可選擇用于防治水產養殖動物的弧菌病。筆者只是在細菌相對穩定的生長環境中進行試驗，沒有考慮到環境和用藥方式等對藥效產生的影響，具有一定的局限性，今后仍需要在養殖環境和用藥方法上進行綜合研究。

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