柿樹內生細菌的分離與鑒定

摘要[目的]了解柿樹內生細菌的多樣性及分布規律。[方法]采用平板分離法對柿樹內生細菌進行首次分離、篩選和鑒定。[結果]從柿樹根、幼莖和葉中共分離出內生細菌11株，不同組織中內生細菌的數量存在差異；經菌落形態特征和顯微形態觀察鑒定分屬于4個屬，即短小桿菌屬（Curtobacterium）1株、芽孢桿菌屬（Bacillus）7株、乳桿菌屬（Lactobacillus）1株、假單胞菌屬（Pseudomonas）2株。[結論]柿樹內生細菌具有生物多樣性。

關鍵詞柿樹；內生細菌；鑒定

中圖分類號S432.4+2文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）24-08175-02

Isolation and Identification of Entophytic Bacteria from Diospyros kaki Thunb

WANG Gengxian et al（School of Life Science and Engineering， Handan College， Handan， Hebei 056005）

Abstract[Objective] The aim was to understand the biological diversity and distribution law of entophytic bacteria from persimmon. [Method] The entophytic bacteria of persimmon were primarily isolated， screened and identified by using plateisolating method. [Result] Eleven strains of entophytic bacteria were isolated from the roots， young stems and leaves of persimmon using the streak plate method. The population densities varied with tissues of the plant. Through the morphology of the colony and microscopic identification， they belonged to four genera， including Curtobacterium （one strain）， Bacillus （seven strains）， Lactobacillus （one strain） and Pseudomonas （two strains）. [Conclusoion] The entophytic bacteria of persimmon have biological diversity.

Key wordsDiospyros kaki Thunb； Entophytic bacteria； Identification

植物內生細菌泛指那些在其生活史的某一階段生活在植物組織內但不引起植物組織明顯病害癥狀的一類微生物[1]。近年來，關于植物內生細菌應用于植物病害防治方面的研究越來越多，目前已成為植物病害生物防治的主要藥源之一，具有較高的理論研究價值和實際應用價值[2]。研究表明，幾乎所有的植物體內都含有內生細菌，并產生內生細菌和其宿主植物長期共存的現象。內生細菌對寄主植物有促生、防病、內生固氮等廣泛的生物學作用[3-4]。

柿樹在全國各地廣為栽培，是古老的栽培果樹之一，也是我國重要的經濟果樹之一[5]。在柿樹的生長過程中常受到多種病原菌的危害，目前我國柿樹病害已知有16種，其中以角斑病、圓斑病和炭疽病發生較普遍且嚴重，給柿子的生產帶來巨大的經濟損失[6]。目前的防治手段主要以化學農藥為主，但長期使用農藥不僅影響柿子的品質，還會給環境帶來危害，所以探尋生物防治的途徑勢在必行。為此，筆者對柿樹內生細菌進行了首次分離、篩選和鑒定，初步研究了柿樹內生細菌的多樣性及分布規律，旨在為今后柿樹微生物防治和內生細菌資源的開發奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試品種。供試柿樹品種為磨盤柿（Diospyros kaki L.f.constricta），于2013年5月采自邯鄲學院校園內。采集健康植株的根、幼莖、葉供試驗用。

1.1.2培養基。分離培養基為營養瓊脂（NA）：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 ml，pH 6.5～7.5。

1.2方法

1.2.1內生細菌的分離和測數。參考饒小莉等[7]的方法，取經表面滅菌徹底的材料1.00 g于無菌研缽中研磨，將研磨的組織加到含0.85%滅菌生理鹽水的錐形瓶中，旋窩振蕩1 min，將上清液倒入滅菌的離心管中沉淀，吸取1.0 ml上清液做梯度稀釋，分別取0.1 ml稀釋液涂布NA平板，每個稀釋濃度3次重復，置于37 ℃恒溫箱培養，3～5 d后計菌落數。根據菌落的形態、顏色、大小等挑取單菌落，反復劃線純化后接斜面保存，供測試鑒定。

1.2.2內生細菌的鑒定。分離細菌菌株的鑒定主要參考《一般細菌常用鑒定方法》[8]和《常見細菌系統鑒定手冊》[9]，測定菌株的形態、培養性狀和生理生化特性。

2結果與分析

43討論

該研究雖然發現柿樹根、幼莖、葉3種器官中存在不同種類的內生細菌，但是提取到的菌株種類與其他研究報道的數10種甚至近百種仍相差很遠。雖然其原因不排除柿樹本身含有的內生細菌種類較少，但是可能與試驗中選用的材料為生長年份較少的柿樹有關，幼嫩組織分裂生長很快導致其內生細菌的含量相對較低。此外，分離內生細菌時采用組織塊分離法，導致非切口處組織的內生細菌很難被提取出來，而將組織研磨破碎得到提取液涂布培養可能會使之得以改善。

植物各種組織內生細菌種類存在差異可能是因為不同器官的結構不同，各器官所處微環境（如通氣、營養、細胞理化環境等）不同。因此，有必要對內生細菌的侵染機理進行研究，以便更好地探究柿樹內生細菌種群分布規律，為今后進一步研究柿樹內生細菌提供依據。該研究為進一步研究內生細菌對柿樹的作用奠定了基礎，不僅使人們對柿樹各組織、器官內可能含有的內生細菌有所了解，而且為柿樹病害的防治提供了新思路。

參考文獻

[1] 張祺玲，楊宇紅，譚周進，等.植物內生菌的功能研究進展[J].生物技術通報，2010（7）：37-44.

[2] 閆孟紅，蔡正求，韓繼光，等.植物內生細菌在防治植物病害中的應用現狀[J].生物技術通報，2004，30（3）：8-12.

[3] 楊海蓮，孫曉璐，送未，等.植物內生細菌的研究[J].微生物學通報，1998，25（4）：224-226.

[4] 羅永蘭，張志遠，喻珺.柑橘內生細菌的分離與鑒定[J].湖北農業科學，2006，45（6）：773-775.

[5] 胡青素，龔榜初，譚曉風，等.柿子的應用價值及發展前景[J].湖南農業科學，2010（1）：103-106.

[6] 郭昌賢.柿樹病害的癥狀與防治[J].安徽農學通報，2008，14（1）：12-13.

[7] 饒小莉，沈德龍，李俊，等.甘草內生細菌的分離及拮抗菌株鑒定[J].微生物學通報，2007（4）：117-123.

[8] 中國科學院微生物所細菌分類組.一般細菌常用鑒定方法[M].北京：科學出版社，1978.

[9] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[K].北京：科學出版社，2001.