轉甜味蛋白Brazzein基因乳腺特異表達載體的山羊體細胞株篩選

摘要[目的] 建立通過山羊乳汁獲取甜味蛋白Brazzein的方法。[方法]將前期工作中構建的Brazzein基因山羊乳腺特異表達載體STPpBC1進行線性化，采用脂質體法轉染山羊成纖維細胞，以期獲得轉基因陽性細胞。[結果] 采用脂質體法轉染山羊成纖維細胞后，通過最適G418濃度（400 μg/ml）篩選獲得轉基因陽性細胞；轉基因陽性細胞形態呈現梭形且核仁清晰，其生長曲線呈現正常的“S”；轉基因陽性細胞經冷凍復蘇后，仍呈現與冷凍前新鮮轉基因細胞相似的形態和生長曲線；PCR鑒定結果表明 ，STPpBC1已整合入轉基因細胞的基因組中。[結論] 成功獲得乳腺特異的轉甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纖維細胞株。

關鍵詞山羊；乳腺特異表達載體；Brazzein基因；轉基因細胞

中圖分類號S827文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）24-08099-03

The Screening and Identification of Transgenic Goat Fibroblast Cells with Sweet Protein Brazzein Gene

WANG Chunsheng， AN Tiezhu et al （College of Life Science， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] In order to obtain transgenic goat fibroblast cells with sweet protein Brazzein gene. [Method] Goat fibroblast cells were transfected with mammary gland specific expression vector STPpBC1 constructed in the previous work by cationic liposome method and cultured G418resistant cell. After PCR identified， transgenic cell line with Tem was established. The G418 positive cells were detected. [Result] Transgenic cell could be obtained by the optimum concentration of G418. Morphology of the transgenic cell and transgenic cells after freezingthawing was similar with normal mammary epithelial cells， the cell growth curve was “S” shape， PCR results showed that the vector constructed was integrated into genome. [Conclusion] The transgenic cells with temporinGFP were filtrated， and lay the foundation for the transgenic goat with expression temporin in mammary.

Key words Goat； Mammary gland specific expression vector； Brazzein gene； Transgenic cell

甜味蛋白Brazzein是西非野生植物Pentadiplandra brazzeana外果皮和種子之間形成的一種蛋白，具有極高的與糖類相似甜味，但其含量僅為果實干重的0.02%～005%[1]。因此，通過植物難以獲得大量的Brazzein蛋白。如果采用轉基因的方法，就能通過動物等生物反應器獲取大量的Brazzein蛋白。為了通過山羊乳汁獲取Brazzein蛋白，筆者利用前期工作[2]中構建的山羊乳腺特異Brazzein基因真核表達轉染山羊成纖維細胞，以期獲得轉Brazzein基因陽性細胞株，為建立通過體細胞移植方法培育乳腺特異表達Brazzein的山羊奠定基礎。

1材料與方法

1.1山羊皮膚成纖維細胞的培養采取約10日齡幼山羊耳廓皮膚組織，采用常規方法，用CO2培養箱（38 ℃、5%CO2、100%濕度），以DMEM（含10%胎牛血清）培養液原代培養山羊皮膚成纖維細胞，并進行3～4代的傳代培養。

1.2最適G418濃度的篩選用分別含有1 000、800、600、400、200、100 和50 μg/μl G418 的DMEM（含10%胎牛血清）培養液培養“1.1”中傳代培養的山羊皮膚成纖維細胞，根據細胞存活狀態，確定篩選陽性細胞的最佳G418濃度。

1.3Brazzein基因真核表達載體的線性化在前期工作[2]中已獲得山羊乳腺特異表達Brazzein基因的真核表達載體，即根據GenBank中甜味蛋白Brazzein基因的mRNA序列（A95587），人工合成Brazzein基因pUC57質粒（命名為STpUC57）；以ST pUC57質粒作為模板，TP1（5′GTCGACATGGCTAAGTTTGCTTCT3′）和TP2（5′GTCGACTTAGTATTCGCAGTAATC3′）為引物，利用rTaq DNA Polymerase進行梯度PCR擴增，對目的條帶進行膠回收，并連接到pMD18Simple載體上，獲得被命名為STPpMD18Simple的表達載體；利用Sal1酶對STPpMD18Simple進行單酶雙酶切，并用Gel Extraction Kit膠回收試劑盒進行膠回收，獲得甜味蛋白Brazzein基因片段；用Xho1酶單酶切乳腺特性載體pBC1獲得線性化乳腺特性載體pBC1載體；Brazzein基因和線性化的山羊乳腺特異性pBC1載體進行連接轉化后，獲得乳腺特異的Brazzein基因真核表達載體（命名為STPpBC1）。將STPpBC1利用NotI酶進行單酶切后進行線性化。

1.4山羊皮膚成纖維細胞的轉染將“1.1”中傳代培養的山羊成纖維細胞，用無抗生素的DMEM（含10%胎牛血清）培養液進行培養，當細胞達到60%～70%后，根據脂質體Lipofect Transfect Reagen（Tiangen）說明，用上述線性化的STPpBC1進行轉染。

1.5轉基因陽性細胞的篩選將“1.4”中用線性化STPpBC1轉染的山羊成纖維細胞，在含有“1.3”中篩選的G418 濃度的DMEM（ 含10%胎牛血清） 溶液中培養，在倒置顯微鏡下，每隔24 h 觀察細胞形態和存活狀態，當未轉染細胞全部死亡后，再用含G418 的培養液繼續篩選7 d，最后用無G418 的培養液傳代培養，觀察計算并繪制細胞生長曲線（ 每個時間點設3個重復）。

1.6轉基因陽性細胞的生物學特性在倒置顯微鏡下，觀察轉基因陽性細胞形態，并檢測其細胞的生長特性；采用常規方法將轉基因細胞進行冷凍復蘇后，觀察其細胞形態，并通過對其續培養觀察其生長特點。

1.7轉基因陽性細胞的PCR 鑒定分別提取山羊成纖維細胞和轉STPpBC1的山羊成纖維細胞基因組，以ST1與ST2為特異性引物進行PCR 鑒定，檢測2種細胞基因組中目的基因的整合情況。PCR 反應體系為25 μl，其中，基因組DNA 2.0 μl（100 ng），dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μl，10×rTaq Buffer 2.5 μl，ST1和ST2引物各1.0 μl，rTaq酶0.25 μl，水 17.25 μl。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃30 s，55.6 ℃30 s，72 ℃30 s，30個循環；72 ℃延伸7 min。

2結果與分析

2.1傳代培養的山羊成纖維細胞形態利用山羊耳廓皮膚組織原代培養其成纖維細胞，在培養后的第3天，組織懸浮塊周邊出現梭形游離的細胞（圖1），其細胞的核仁清晰，并開始逐漸貼壁，進入指數期；在培養后第7天，細胞貼壁生長達到80%～90%匯合；當將原代培養山羊成纖維細胞進行傳代培養時，在培養后的第4天，細胞可達80%匯合（圖2）。

圖1原代培養的山羊成纖維細胞（100×）圖2傳代培養的山羊成纖維細胞（100×）2.2篩選轉基因陽性細胞的最適G418濃度采用“1.3”方法篩選最適G418濃度，結果表明，與添加其他濃度的G418相比，當添加G418的濃度為400 μg/ml時，第9天細胞全部死亡，以此確定G418的最適濃度為400 μg/ml（圖3）。

圖3篩選轉基因細胞的最適G418濃度2.3轉基因陽性細胞形態及其生長特性將線性化的STPpBC1轉染山羊成纖維細胞并經G418篩選，對篩選的轉基因進行續培養。在續培養后第3天，在倒置熒光顯微鏡下，其細胞能夠呈現出與原代培養的山羊成纖維細胞相似的梭形，且核仁清晰；在續培養后的第7天，細胞間隔逐漸消失，呈梭形貼壁生長（圖4）；轉STPpBC1 的山羊成纖維細胞的培養生長曲線（圖5） 顯示，開始培養后的前3 d生長緩慢，且數量少于對照組，第4～6天細胞較快增殖，第7天后細胞數量變化趨于平緩，細胞生長曲線呈S形，符合細胞生長的生物學規律。

圖4轉基因山羊成纖維細胞細胞（100×）圖5轉基因細胞的生長曲線2.4經冷凍復蘇的轉基因陽性細胞形態及其生長特性將冷凍保存的轉基因細胞，經復蘇后進行續培養。在續培養后第24 h，細胞開始貼壁生長，其細胞形態呈梭形（圖6）。經續培養后的第96 h，細胞達到約80%匯合；與未經冷凍的轉基因細胞相似，經冷凍復蘇的轉基因陽性細胞曲線呈S形，符合細胞生長的生物學規律（圖7）。

圖6經冷凍復蘇的轉基因細胞圖7經冷凍復蘇的轉基因細胞生長曲線2.5轉基因細胞的PCR檢測收集經轉染STPpBC1，且利用含G418 的培養基篩選具有正常增殖能力的山羊成纖維細胞后，提取基因組DNA，并進行PCR 擴增。結果顯示，2 處理組均可擴增出目的條帶，與陽性對照（STPpBC1）擴增條帶大小一致，陰性對照（正常山羊基因組DNA） 未擴增出條帶（圖8）。

注：1.陰性對照；2.D2000plus Marker；3、4.轉基因細胞；5.陽性對照。

圖8轉基因細胞的PCR鑒定3討論

目前，已發現具有甜味的主要蛋白有Miraculin[3]（存在于非洲西部植物Richadella dulcifera）、Curculin[4]（存在于仙矛植物）、Thaumatin[5]（存在于西非植物Thaumatococcus daniellii）、Monellin[6]（存在于熱帶植物Dioscoreophyllum cumminsii）、Mabinlin[7]（存在于我國云南植物Capparis masaikai）和Brazzein[8]（存在于西非野生的植物Pentadiplandra brazzeana），其中，由于Brazzein甜度高達相同質量蔗糖的2 000倍[9]而備受關注。

一般情況下，具有甜味蛋白的植物對其生長所需條件苛刻，且在其干物質中甜味蛋白的含量甚微[10]。為此，人們探索了采用轉基因方法，通過馬鈴薯和煙草表達Thaumatin蛋白[11]，通過大腸桿菌以及枯草芽孢桿菌[12]和畢赤酵母[13]表達Brazzein蛋白等方法，但未能獲得理想的效果。

大量研究證實，選擇組織特異性啟動子與外源目的基因構建的真核表達載體并通過轉基因方法能使外源基因在機體特異組織中表達。目前，利用乳腺細胞的特異性啟動子和外源基因構建的表達載體，分別獲得乳腺特異表達β-酪蛋白轉基因小鼠[14]、表達α1antitrypsin（抗胰蛋白酶）的綿羊[15]等。此外，隨著體細胞克隆技術的不斷完善，體細胞克隆效率不斷提高，獲得體細胞克隆動物的種類和數量不斷增加。自SCHNIEKE等[16]首次以轉染外源DNA的綿羊成纖維細胞為核供體，通過細胞核移植方法成功獲得了轉基因綿羊以來，利用該方法已相繼獲得轉基因牛[17]、豬[18]和山羊[19]。上述結果表明，將利用組織特異性啟動子和外源基因構建的真核表達載體轉染體細胞后，通過體細胞核移植方法，就能獲得組織特異表達外源基因的轉基因動物。

迄今為止尚未見到有關甜味蛋白基因在動物乳腺中表達的相關報道。為了建立甜味蛋白基因Brazzein在山羊乳腺中表達的方法，該研究利用前期工作中構建的山羊乳腺特異表達載體STPpB（Brazzein）C1，經線性化后轉染傳代培養的山羊成纖維細胞（圖1、2），并通過最適G418濃度400 μg/ml（圖3）進行轉基因陽性細胞篩選，結果表明，獲得細胞形態和生長曲線正常（圖4、5）的轉基因陽性細胞；經冷凍復蘇后，轉基因陽性細胞仍呈現正常形態和生長特性；PCR鑒定結果表明，STPpBC1已整合到轉基因細胞的基因組中。上述結果表明，該研究成功獲得乳腺特異的轉甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纖維細胞株。能否利用該細胞通過體細胞核移植的方法獲得乳腺特異表達甜味蛋白的轉基因山羊有待于進一步探討。

42卷24期王春生等轉甜味蛋白Brazzein基因乳腺特異表達載體的山羊體細胞株篩選參考文獻

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