環酯紅霉素干混懸劑的檢查技術

【摘要】 目的 通過對環酯紅霉素干混懸劑進行驗證試驗，確定適宜的微生物限度檢查的方法。方法及結果 細菌采用薄膜過濾法，當沖洗量為1 000 mL 時可消除抑菌作用；真菌采用常規法檢驗，人工污染真菌的回收率均高于70%。結論 環酯紅霉素干混懸劑微生物限度檢查細菌應采用薄膜過濾法，沖洗量為1 000 mL ；真菌采用常規法檢驗，大腸埃希菌采用薄膜過濾法，沖洗量為800 mL。

【關鍵詞】環酯紅霉素 檢查方法

【中圖分類號】R927 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）05-0275-02

環酯紅霉素干混懸劑為新型大環內酯類抗生素，是紅霉素的半合成衍生物，環酯化后的紅霉素降低了血清蛋白結合率，提高了抗菌活性和降低了毒性；本品為廣譜抗生素，其注冊質量標準中未列微生物限度的檢驗方法。為此，本文對環酯紅霉素干混懸劑的微生物限度的檢查方法進行了驗證試驗。

1 試驗材料

1.1 樣品 環酯紅霉素干混懸劑，批號：061101，規格：0.125 g/包，生產廠家： 海南澳美華制藥有限公司。

1.2 菌種：大腸埃希菌CMCC（B） 44102、枯草芽孢桿菌CMCC（B） 63501、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、白色念珠菌CMCC（F）98001、黑曲霉CMCC（F）98003 由 中國 藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養基 玫瑰紅鈉瓊脂，批號：040929；營養瓊脂，批號：060214；營養肉湯，批號：060117；真菌培養基，批號： 050103；膽鹽乳糖培養基，批號： 060117 ，均由北京三藥科技開發公司提供；MUG，批號：051207，由北京牛牛基因技術有限公司提供。

2 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的驗證

2.1 菌液制備

2.1.1 取經37 ℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養物1 mL加9 mL鹽水，10倍稀釋至10-5 ～10-7，細菌數約為50～100 cfu/mL，做活菌計數備用。

2.1.2 取經25 ℃培養18～24 h的白色念珠菌真菌液體培養物1 mL加9 mL鹽水，10倍稀釋至10-5～10-6，細菌數約為50～100 cfu/mL，做活菌計數備用。

2.1.3 取經25 ℃培養1周的黑曲霉斜面培養物，加3～5 mL鹽水洗下真菌孢子，吸取出菌液， 然后取1 mL 加9 mL鹽水，10倍稀釋為10-3，細菌數約為50～100 cfu/mL，做活菌計數備用。

2.2 供試品的制備 取本品10 g，溶于100 mL的pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液中，作為1∶10供試液。

2.3 試驗組 分別取1∶10供試液，以500 r/min離心5 min，，分別取上清液1 mL薄膜過濾，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液沖洗，每次100 mL，在最后一次沖洗液中分別加入試驗菌少于100 cfu/mL金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌1 mL；過濾取出濾膜，分別貼于營養瓊脂平皿中于30～35 ℃培養，每天觀察結果，計數。

2.4 菌液組 測定每一菌株的試驗菌數，采用平板菌落計數法。

2.5 供試品組 不加菌液，其他操作同試驗組，測量樣品本底菌數。

2.6 稀釋劑對照組 取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，按試驗組的沖洗量過濾，在最后一次沖洗液中逐一加入試驗菌，取出濾膜分別接種于相應培養平皿中培養計數。

2.7 結果 采用薄膜過濾法測定的回收率結果。結果表明，當沖洗量為1 000 mL時，可消除抑菌作用。

3 黑曲霉菌和白色念珠菌的驗證

3.1 供試品的制備 取本品10 g，溶于100 mL的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，制成1∶10的供試液。

3.2 試驗組 取2組平皿，每組2個，分別取1∶10供試液1 mL和50～100 cfu/mL試驗菌株1 mL同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，于24～28 ℃培養，每天觀察結果，計數。

3.3 菌液組 測定每一菌株的試驗菌數，采用平板菌落計數法。

3.4 供試品組 不加菌液，其他操作同試驗組，測量樣品本底菌數。

3.5 結 果 采用常規法測定的回收率結果。結果表明黑曲霉菌和白色念珠菌的回收率均大于70%。

4 控制菌大腸埃希菌檢查方法驗證

4.1 供試品的制備 取本品10 g，溶于100 mL的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，以500 r/min離心5 min（10 mL/管），合并上清液作為1∶10的供試液。

4.2 試驗組 取1∶10供試液10 mL，薄膜過濾，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液沖洗，每次100 mL，共沖洗8次， 在最后一次沖洗液中分別加入1 mL大腸埃希菌，過濾取出膜，培養于100 mL膽鹽乳糖增菌液中，于 30～35 ℃培養24 h，觀察結果。

4.3 陰性對照組 取1∶10供試液10 mL，薄膜過濾，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液沖洗，每次100 mL，共沖洗8次， 在最后一次沖洗液中分別加入1 mL金黃色葡萄球菌液，過濾，取出膜培養于100 mL膽鹽乳糖增菌液中，于 30～35 ℃培養24 h，觀察結果。

4.4 取上述培養物各0.2 mL接種至5 mLMUG培養基試管內培養，于5 h、24 h在365 nm的紫外燈下觀察，同時用未接種的MUG培養基做本底對照。

5 討論

5.1 結果可知，環酯紅霉素干混懸劑細菌數檢查采用薄膜過濾法，通過不同的沖洗量，測定人工染菌回收率，總沖洗量為800 mL時，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率均低于70%，方法還是不可行；當總沖洗量為1 000 mL時，人工污染3株代表菌株，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%，符合 中國 藥典微生物限度驗證方法的要求，故可采用薄膜過濾法進行檢驗。

5.2 環酯紅霉素干混懸劑為廣譜抗生素，主要作用于細菌，結果可知，采用常規法測定真菌和酵母菌數，人工污染2株代表菌株，白色念珠菌、黑曲霉回收率均高于70%，符合規定中國藥典微生物限度驗證方法的要求，所以真菌和酵母菌數驗證方法首選常規法。

5.3 環酯紅霉素干混懸劑的大腸埃希菌檢查可采用薄膜過濾法，沖洗量為800 mL。

5.4 據上述結果，環酯紅霉素干混懸劑微生物限度檢查中的細菌數采用薄膜過濾法進行檢查，即取本品10 g，置100 mLpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，以500 r/min離心5 min，取上清液1 mL，照薄膜過濾法處理，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液，沖洗量為1 000 mL，真菌和酵母菌數采用常規檢驗，大腸埃希菌可用薄膜過濾法，沖洗量為800 mL。

參考文獻

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