不同方法制備的黃連解毒湯提取液指紋圖譜比較分析

摘要：

目的：比較分析SBE法（半仿生提取法）、AE法（醇提取法）制備的黃連解毒湯提取液的指紋圖譜，以驗證黃連解毒湯的最佳提取方法。方法：以RP-HPLC法測定SBE法、AE法制備的相對分子質量小于等于1000的黃連解毒湯提取液的指紋圖譜。結果： SBE法制備的黃連解毒湯提取液的結果大于AE法制備的黃連解毒湯提取液的結果。結論：SBE法制備的相對分子質量小于等于1000的黃連解毒湯提取液中的成分最多。

關鍵詞：SBE法；AE法；黃連解毒湯；提取液；指紋圖譜

【中圖分類號】

R195 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）08-0269-02

黃連解毒湯出自《外臺秘要》，組方由黃柏、黃芩、黃連、梔子組成，有瀉火、解毒、清熱之功效^[1]。經現代研究證實，其藥理活性具有抗炎、抑菌、抗腦缺血缺氧、抗氧化、提高免疫力等主要作用^[2]。本文旨在比較分析SBE法（半仿生提取法）、AE法（醇提取法）制備的黃連解毒湯提取液的指紋圖譜，以驗證黃連解毒湯的最佳提取方法，具體報告如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器：電子分析天平（MA110型），精密pH計（pHS-3C型），高效液相色譜儀（Waters-2695），紫外分析儀（UV3010型），醫用超聲波清洗器（KQ-250E型），中空纖維超濾膜（DH-系列）。

1.2 試藥：黃柏飲片、黃芩飲片、黃連飲片，梔子飲片，梔子苷、黃芩素、鹽酸小檗堿（中國生物制品研究所），甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、超純水，三氯甲烷（分析純）。

2 方法

2.1 樣品液制備方法：SBE液制備方法：按照處方的比例精確稱取100g方藥粗粉（10目-20目），按照SBE法的提取工藝及藥材組合方式（黃柏和黃芩合煎，黃連和梔子合煎，然后合并煎液），再分別浸泡30分鐘，分別以SBE法進行3次提取，加水量按照藥量的10倍、8倍、8倍添加，3煎的pH值分別為2.0、7.0和9.0，提取時間分別為2小時、1.5小時、1.5小時，然后將3煎的提取液過濾、離心，以中空纖維超濾膜（相對分子質量=1000）濾過、濃縮、合并，將提取液定容到500ml，得到相對分子質量小于等于1000的黃連解毒湯提取液（含有200g/L生物藥）。

AE液制備方法：按照SBE液制備方法，以乙醇（60﹪）為作溶劑，按照上述方法得到相對分子質量小于等于1000的黃連解毒湯提取液（含有200g/L生物藥）。

2.2 供試品溶液制備方法：精確稱取2種樣品液各10ml，置于蒸發皿內，水浴中蒸發濃縮至近干，加0.8g硅藻土，拌勻、蒸干、研勻，置于磨口三角瓶（100ml）內，加入25ml甲醇溶解，稱定質量，進行30分鐘超聲提取，補足減失質量，以布氏漏斗將殘存硅藻土濾除。精密吸取2種濾液各2.5ml，以甲醇定容到10ml，即得到2種供試品溶液（含有20g/L生藥）^[3]。

2.3 對照品溶液制備方法：精確稱取5.10mg梔子苷對照品，2.32mg小檗堿對照品，1.96mg黃芩素對照品，以甲醇定容到10ml，即得。

2.4 色譜條件：PLATISIT C18-色譜柱（25cm*0.46cm，5m）；流動相A：0.1﹪磷酸和0.02 moL/L磷酸二氫鉀。流動相B：乙腈；流速：0.8ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：225nm；進樣量：20ul。

梯度洗脫

3 方法學考察

3.1 精密度：取供試品SBE溶液，連續進5針，得指紋圖譜，計算各峰的保留時間RSD及峰面積RSD。

3.2 重現性：取樣品溶液和供試品溶液5份，進樣檢測，計算各峰的保留時間RSD及峰面積RSD。

3.3 穩定性：取供試品SBE溶液，分別在0H，2H，6H，12H，24H進樣檢測，計算各峰的保留時間RSD及峰面積RSD。

4 結果

4.1 方法學考察中的精密度、重現性及穩定性均滿足要求。各峰Rt（相對保留時間）的RSD<1.0%，各峰相對峰面積RSD<5.0%，溶液在24小時內穩定。

4.2 特征峰，SBE法制備的黃連解毒湯提取液存在23個特征峰，AE法制備的黃連解毒湯提取液缺少5個特征峰。

4.3 重疊率，特征峰相似度以夾角余弦法計算，結果SBE法制備的黃連解毒湯提取液的結果大于AE法制備的黃連解毒湯提取液的結果，這和共有特征峰的重疊率計算結果相符。

4.3 峰面積，比較鹽酸小檗堿、黃芩素、梔子苷的指標成分、共有特征峰的總面積，結果SBE法制備的黃連解毒湯提取液的結果大于AE法制備的黃連解毒湯提取液的結果。

3 討論

相關研究顯示，對380多種常用中藥的活性成分進行統計分析，多數中藥的相對分子質量在1000以下，這符合“中藥活性成分分子量表”的統計結果，所以本研究以相對分子質量小于等于1000的提取液測定指紋圖譜，是中藥整體、客觀、模糊、綜合的特點予以體現，為研究現代藥物的新劑型提供有效的技術支持，為提取中藥未知物質拓展思路^[4]。SBE法（半仿生提取法）是依據中藥及方劑中的部分已知成分，結合整體的藥物研究方法和分子藥物的研究方法，從生物藥劑學的角度，對口服給藥、藥物胃腸道轉運過程進行模擬，為中藥制劑（經消化道給藥）設計出新的提取技術。該方法的提取工藝重視有成分論和藥效學反應，綜合評價總浸出物、有效成分、不同極性部分的指標及藥理作用，對提取工藝進行優選，重視綜合成分作用。本研究顯示，SBE法在提高有效成分提取率、藥學指標方面優于AE法。

綜上所述，SBE法制備的相對分子質量小于等于1000的黃連解毒湯提取液中的成分最多。

參考文獻

[1]陳麗靜，孫秀梅，張兆旺，等.3種方法制備的黃連解毒湯提取液指紋圖譜比較[J].中草藥，2013，43（3）：487-491.

[2]彭娟，郭娜，范斌，等.黃連解毒湯高效液相色譜指紋圖譜研究及指標成分的含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（10）：67-70.

[3]沈嘉，曹現峰，劉九飛.幾種黃連解毒湯的HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2003，25（6）：434.

[4]竇錦明，孫秀梅，張兆旺，等.黃連解毒湯方藥3種方法提取液成分比較[J].時珍國醫國藥，2010，21（6）：1369-1371.