HPLC法測定桂蒲腎清片中咖啡酸含量

摘要：

目的： 建立HPLC法測定桂蒲腎清片中咖啡酸含量。方法：采用高效液相色譜法測定蒲公中咖啡酸的含量。結果咖啡酸在進樣量在在25.68-141.24μg范圍內有良好，平均回收率為RSD為1.14%（n=6）。結論：所建立的方法測定樣品中咖啡酸準確可靠、靈敏度高、專屬性強，可有效控制桂蒲腎清片的的質量。

關鍵詞：桂蒲腎清片；咖啡酸； 高效液相色譜法

【中圖分類號】

R453 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）08-0066-02

桂蒲腎清片由訶子、菥蓂子、人工牛黃、蒲公英、三七、雞內金、肉桂、菟絲子、蓮子、琥珀、阿膠、澤瀉等12味藥，具有清熱利濕解毒，化瘀通淋止痛。用于濕熱下注、毒瘀互阻所致尿頻、尿急、尿痛、尿血、腰疼乏力等癥；尿路感染，急慢性腎盂腎炎、非淋菌性尿道炎見上述癥候者。^[1]該制劑由桂蒲腎清膠囊改劑型而來，原質量標準中采用薄層掃描法測定人工牛黃中的膽酸，為更好的控制產品質量，建立HPLC法測定方中的君藥蒲公英中的咖啡酸含量的方法。

1 儀器與試藥

儀器：島津LC-2010AHT型高效液相色譜儀；十萬分之一電子分析天平；HS12060D型超聲波清洗器（功率：250w； 頻率：40 khz）。離心機（功率：25W；最高轉速：4000r/min）。

試藥：色譜甲醇；水（重蒸水）；磷酸；咖啡酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110885-200102 ，供含量測定用）；樣品（貴州順健制藥有限公司自制，批號：20060501；20060502；20060503）。

2 色譜條件的選擇

色譜柱： 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑柱；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（21：79）；流速：1.0ml/min ；柱溫：30℃；檢測波長：323nm。

3 對照品溶液的制備

精密稱取在110℃干燥至恒重的咖啡酸對照品10.70mg置50ml量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取取2 ml，置10量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

4 供試品溶液制備

取本品，除去薄膜衣，研細，取約2g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，加入適量石油醚（30-60℃），索氏提取6h，揮干石油醚，殘渣精密加入5%甲酸的甲醇溶液20ml，超聲30分鐘，冷卻，搖勻，離心（2000r/min）10min，取上清液，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

5 方法學考察

5.1 系統適應性試驗： 分別精密吸取對照品溶液、陰性供試品溶液、空白溶液及供試品溶液各15μl，按上述色譜條件注入色譜儀，見圖1。陰性對照品溶液色譜圖在咖啡酸峰位置無色譜峰，表明其他組分對測定無干擾咖啡酸峰與相鄰組分峰的分離度大于1.5 ，理論板數以咖啡酸峰計不小于2000。

C 缺蒲公英陰性溶液

5.2 線性關系的考察： 精密吸取咖啡酸對照品貯備液（C=12.84μg/ml）2μl、3μl、5μl、7μl、9μl，11μl（即分別含咖啡酸25.68μg、38.52μg、64.20μg、89.88μg、115.56μg、141.24μg） 分別注15μl入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖，并以對照品的進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y = 4140.4 x -5246.6 R2 = 0.9996，結果表明，咖啡酸在25.68-141.24μg范圍內有良好的線性關系。

5.3 精密度試驗： 精密吸取對照品溶液（C=4.28μg/ml）15μl，平行進樣6次，測定咖啡酸峰面積值。結果相對標準偏差RSD=1.7%，表明儀器精密度良好。

5.4 穩定性試驗： 精密吸取同一供試品溶液（批號：20060501）各15μl，在室溫0小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時進行測定咖啡酸峰面積。結果表明， RSD為1.67（n=6），表明咖啡酸在10小時內穩定性良好。

5.5 重復性試驗： 取本品，除去薄膜衣，研細，精密稱取各2g，共6份，依法制備供試品溶液并測定含量。結果RSD為0.26%（n=6），表明該方法重現性良好。

5.6 加樣回收率試驗：取已知含量的同一批樣品（咖啡酸含量為32.6687μg/g，批號：20060501）各約1g，共6份，精密稱定，按照樣品中咖啡酸含量的100%的比例分別加入咖啡酸貯備液（每1ml含咖啡酸34.24μg）1ml，按供試品溶液的制備方法制備成供試品溶液，精密吸取供試品溶液各15μl進樣，按照上述色譜條件測定含量。實驗結果回收率平均值為98.41%，RSD=1.14%（n=6），回收率試驗良好。

5.7 樣品測定：分別取10批樣品適量，按上述方法測定咖啡酸含量（單位：μg/片）分別為：12.88、12.88、13.03、12.92、12.90、13.11、12.99、13.05、12.92、12.94。

6 討論

試驗中考察了不同提取方法，不同提取溶劑，不同提取方法時間，結果樣品中測定咖啡酸含量樣品制備方法為取本品，除去薄膜衣，研細，取約2g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，加入適量石油醚（30-60℃），索氏提取6h，揮干石油醚，殘渣精密加入5%甲酸的甲醇溶液20ml，超聲30分鐘，冷卻，搖勻，離心（2000r/min）10min，取上清液，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。能有效測定樣品中的咖啡酸。

本制劑由12味中藥材組方，本試驗除了與原桂蒲腎清膠囊測定人工牛黃中膽酸的含量，同時還對蒲公英中的咖啡酸進行含量測定，此質量控制方法能很好控制產品質量。

參考文獻

[1]中華人民共和國國家藥品監督管理局WS-11110（ZD-1110）-2002