小檗堿對金黃色葡萄球菌誘導的ECV—304細胞凋亡相關基因的影響

摘要：

目的：研究小檗堿對金黃色葡萄球菌（S.aureus）誘導ECV-304細胞內凋亡相關基因Bcl-2、Bax和Caspase-3表達的調節作用。方法：小檗堿（Berberine，BBR）預處理ECV-304細胞2h后，用S.aureus感染細胞，采用半定量RT-PCR及Western-blot法檢測金黃色葡萄球菌感染后ECV-304細胞內Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA及蛋白表達水平。結果：小檗堿預處理ECV-304后再感染S.aureus可顯著性增加凋亡相關細胞因子Bcl-2mRNA水平及蛋白表達量，而Bax和Caspase-3表達下調。結論：小檗堿可以調節S.aureus誘導的ECV-304細胞內凋亡相關基因的表達，抑制ECV-304細胞凋亡。

關鍵詞：小檗堿；金黃色葡萄球菌；ECV-304；凋亡

EffectsofberberineonapoptosisrelatedgenesofECV-304cellsinducedbystaphylococcusaureus

Peide-cui，Xiongchuan-yin，Biai-fen，Huhan-bin

Abstract：

DepartmentofClinicalLaboratory，GuangzhouHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，Guangzhou，Guangdong510800，China

AbstractObjective：TostudytheprotectionofberberineagainstECV-304apoptosisinducedbyStaphylococcusaureus（S.aureus）viaregulatingBcl-2，Baxandcaspase-3expression.Methods：ECV-304werepretreatedwith128μg/mLBBRfor2h，thenSaureuswasadded.Theexpressionlevelsofapoptosisrelatedgenesweredetectedwithsemi-quantityRT-PCRandWestern-blot.Results：PretreatmentofBBRhelpedtosurviveinSaureus-inducedECV-304.BBRsignificantlyincreasedtheexpressionlevelsofBcl-2anddecreasedthatofBaxandCaspase-3afterstaphylococcusaureusinfection.Conclusion：BerberinecanregulatetheexpressionofapoptosisrelatedgenesofECV-304cellsinducedbyS.aureus.

Key words：Berberine（BBR）；Staphylococcusaureus（S.aureus）；ECV-304cells；apoptosis

【中圖分類號】

R856.2 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）08-0003-02

小檗堿又名黃連素，是一種具有悠久藥用歷史的異喹啉類生物堿，臨床長期用于抗腸道細菌感染^[1]。研究表明，小檗堿能改善炎癥細胞因子誘導的腸上皮細胞內質網壓力，下調細胞內JNK的磷酸化及caspase-12和caspsae-3水平，從而抑制炎癥細胞因子誘導的細胞凋亡^[2]。金黃色葡萄球菌可以感染并誘導人臍靜脈內皮細胞發生凋亡^[3]，在機體內，細胞凋亡有利于細菌侵入及毒素的擴散，從而引起組織損傷，抑制細胞凋亡對感染性疾病的控制具有一定意義。本實驗的目的是了解小檗堿是否可以調節S.aureus感染的ECV-304細胞內凋亡相關基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達，為治療其感染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞系：

S.aureu標準菌株ATCC25923由本實驗室常規保存，培養基為哥倫比亞血瓊脂平板（梅里埃）及LB培養基（Oxoid）。ECV-304由四川大學華西基礎與法醫學院微生物教研室保存并提供，細胞培養基為RPMI1640（Hyclone）。

1.1.2 主要試劑：

鹽酸小檗堿購自本院藥房（康和藥業），RPMI1640培養基和胎牛血清（Hyclone），TRIzol試劑（Invitrogen），反轉錄試劑盒（Fermentas），PVDF膜（millipore），細胞裂解液和ECL試劑盒（Beyotime），一抗及羊抗兔IgG（Boster）。

1.2 方法

1.2.1 藥物原液的配制及保存：

稱取鹽酸小檗堿，用無菌去離子水配制成2048μg/mL的藥液，0.22μm濾膜過濾除菌后分裝于滅菌的EP管中，置-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 細菌和細胞培養：

將甘油保存的標準菌株轉種血瓊脂平板，37℃過夜培養，取單菌落接種于3mlLB液體培養基，置37℃恒溫培養箱，200rpm振蕩過夜，至細菌生長平臺期。ECV-304用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，在37℃，5%CO2條件下常規培養。

1.2.3 小檗堿預處理S.aureu感染ECV-304細胞：

LB過夜培養的細菌離心集菌，然后無菌PBS洗3次，用不含雙抗的RPMI1640培養液重懸備用。胰蛋白酶消化ECV-304，無菌PBS漂洗3次后用不含抗生素的RPMI1640重懸，接種12孔板，37℃放置30min。實驗分對照組（C），BBR組，S.aureus組及BBR+S.aureus共四組。BBR組和BBR+S.aureus組孔內分別加128μg/mL的BBR預處理2h后，每孔按照細胞：細菌=1：100的比例將細菌懸液加入相應孔內，37℃培養24h。

1.2.4 細胞總RNA提取：

采用TRIzol一步法提取細胞總RNA，用DEPC處理水20μl溶解RNA。

1.2.5 反轉錄及PCR擴增：

按照反轉錄試劑盒說明書上的操作將提取的總RNA反轉錄為cDNA，用cDNA作為模板PCR擴增相關基因，基因引物序列及擴增片段大小見表1，引物合成由上海Invitrogen公司完成。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并在紫外燈下觀察拍照。以GAPDH為內參，BandScan軟件分析各個條帶的光密度值，計算各組細胞因子mRNA表達相對值（目的基因/內參基因）。

1.2.6 WB檢測凋亡相關蛋白表達：

每孔加入100μl0.25%胰酶，37℃消化5min后加入1ml完全培養基終止消化，吹下細胞并分別收集于1.5mlEP管，4000rpm5min離心，棄上清收集細胞。加入150μl細胞裂解液及2μlPMSF，于冰上反復吹打2min，將EP管置于冰上，每5min振蕩一次共30min使細胞充分裂解，4℃，12000rpm離心15min，上清為總的細胞蛋白溶解成分。按常規方法進行SDS-PAGE，分離膠12%，濃縮膠5%，電泳時間1.5h。350mA恒流電泳90min轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉中4℃封閉過夜，然后用1×TBST漂洗3次，封閉后的膜放入雜交袋中，加入1：200稀釋的一抗于袋內，4℃過夜，TBST漂洗3次加PBS1：5000稀釋的羊抗兔IgG二抗，置37℃孵育1h，TBST振蕩洗膜3次，每次10min。ECL方法顯色后用BIO-RAD凝膠成像儀檢測蛋白并拍照。以β-actin蛋白為內參，BandScan軟件分析條帶的光密度值，計算各組細胞因子蛋白的相對表達量（目的蛋白/內參蛋白）。

1.2.7 統計學分析：

所有實驗均重復3次，各組數據采用X±s表示，結果用SPSS16.0統計軟件中的

2 結果

2.1 凋亡相關細胞因子mRNA水平改變：電泳結果用BandScan軟件進行灰度分析，計算各組細胞因子mRNA表達相對值（目的基因/內參基因）。結果表明S.aureus的感染導致Bcl-2、Bax和caspase-3mRNA表達與正常對照組相比較有顯著性差異（p<0.05），感染S.aureus的細胞抗凋亡因子Bcl-2表達顯著性下降，而促凋亡細胞因子Bax和caspase-3表達量顯著性增加。用BBR處理后再感染S.aureus發現，與S.aureus組比較，Bcl-2的表達量顯著性上升而Bax和caspase-3表達量顯著性下降（p<0.05，圖1）。

*p<0.05與對照組（C）相比，**p<0.05與S.aureus組相比

2.2 凋亡相關細胞因子蛋白水平改變：BandScan軟件分析WesternBlot條帶的光密度值，計算各組細胞因子蛋白的相對表達量（目的蛋白/內參蛋白），結果顯示，S.aureus的感染導致Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達量與正常對照組相比較有顯著性差異（p<0.05，圖2），用BBR處理后再感染S.aureus發現，Bcl-2蛋白表達量與S.aureus組比較顯著性上升而Bax和caspase-3蛋白表達量顯著性下降。

3 討論

細胞凋亡是有核細胞在凋亡刺激信號作用下通過啟動細胞內死亡機制，經過一系列信號轉導途徑，最終發生細胞程序性變性和死亡的過程。細胞在凋亡的過程中，凋亡基因對細胞凋亡的發生起重要作用，其中Bcl-2家族中Bcl-2和Bax基因分別是代表性的抑制凋亡和促進凋亡的基因，且Bax是Bcl-2活性的主要調控因子^[4]。半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶系統，其中Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”，一旦被激活，凋亡不可避免^[5]。我們的研究結果顯示，當用BBR預處理細胞后再用S.aureus感染，細胞內抗凋亡因子Bcl-2表達上升，而促凋亡因子Bax和Caspase-3表達量下降。Bcl-2具有保護細胞的功能，該結果表明小檗堿可以通過調節凋亡相關因子Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達來保護S.aureus誘導的ECV-304細胞凋亡。

S.aureus是醫院感染和社區感染的重要病原菌之一，近年來由于抗生素的廣泛使用導致大量耐藥菌株的產生，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的出現使該菌感染的治療變得更為困難^[6]。MRSA治療難度大，病死率高，尤其是對萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌（VRSA）的出現使得抗生素的選擇尤為謹慎，新的治療藥物的研究及開發迫在眉睫。小檗堿又名黃連素，是一種具有悠久藥用歷史的異喹啉類生物堿，作為清熱解毒藥和抗菌藥在臨床上已應用多年。研究發現，小檗堿能通過干擾細菌代謝及DNA合成等途徑發揮抗菌作用，并且其可增加MRSA對β-內酰胺類抗生素的敏感性，兩者聯用對MRSA有協同抗菌作用[7，8]。本實驗結果表明，作為傳統抗炎、抗菌中藥成分的BBR還可能通過抑制S.aureus誘導的細胞凋亡而起到抗菌作用，這可能是BBR對S.aureus引起的感染具有一定療效的機理之一。

本研究我們采用S.aureus感染ECV-304為體外感染模型，檢測感染細胞及BBR預處理細胞內凋亡相關基因的mRNA及蛋白表達水平的變化，了解BBR抗S.aureus感染的機理。結果表明BBR通過調節凋亡相關基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達來抑制S.aureus誘導的ECV-304細胞凋亡。本實驗結果為以后找到一種理想、有效而不會產生耐藥性的預防及治療S.aureus感染的中藥成分提供實驗依據，為形成具有我國特色的用中藥防治感染性疾病的體系提供支持。

參考文獻

[1]郝鈺，徐泊文，鄭宏，等.小檗堿對人臍靜脈內皮細胞增殖與凋亡的作用[J].中國病理生理雜志，2005，21（6）：1124-1127。

[2]HaoXH，YaoAL，GongJF，etal.BerberineAmelioratesPro-inflammatoryCytokine-InducedEndoplasmicReticulumStressinHumanIntestinalEpithelialCellsInVitro[J].Inflammation，2012，35（3）：841-849.

[3]熊傳銀，羅慶華，胡漢斌，等.金黃色葡萄球菌誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡的觀察[J].熱帶醫學雜志，2013，13（5）.

[4]吉木斯，李存保.Bcl-2家族在線粒體細胞凋亡途徑中的作用[J].內蒙古醫科大學學報，2013，35（2）：152-157.

[5]趙瑞杰，李引乾，王會，等.Caspase家族與細胞凋亡的關系[J].中國畜牧雜志，2010，46（17）：73-77.

[6]黃健云，李璐琳，孫紅，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染情況調查及藥敏分析[J].實用醫學雜志，2012，28（20）：3460-3462.

[7]方波，周成合，周向東.小檗堿類抗微生物化合物研究進展[J].國際藥學研究雜志，2010，37（2）：105-109.

[8]陳廣燦，周樹勤，劉淑慧，等.小檗堿與β-內酰胺類抗生素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的協同抗菌作用[J].廣東醫學，2011，32（14）：1812-1814.