嚴格厭氧微生物甲烷古菌分離純化實驗的改進

摘 要：目的：探索和改進分離純化嚴格厭氧微生物甲烷古菌技術。方法：稀釋滾管分離法。結果：對厭氧消化器中甲烷菌進行富集、多次稀釋滾管分離獲得甲烷菌純培養。結論：稀釋滾管分離培養技術方法可靠，分離的效果好，適用于各種嚴格厭氧微生物的分離純化。

關鍵詞：甲烷古菌； Hungate除氧系統； 富集； 滾管分離； 純培養

中圖分類號：Q939文獻標識碼：A 文章編號：1006-3315（2014）04-170-003

厭氧微生物的分離是黔南民族師范學院微生物課程開放性實驗項目之一。目前國內高校多數實驗室對嚴格厭氧菌分離純化主要采用焦性沒食子酸法、厭養罐法、厭養培養箱法等[1]。焦性沒食子酸法進行厭養菌分離培養，由于其方法簡單，操作容易，在大專院校微生物實驗教學中仍廣泛使用，但操作過程厭氧條件不易控制，特別是對嚴格厭氧的甲烷古菌分離效果差。厭養罐法能夠為厭氧菌生長提供嚴格厭氧的環境，但不能為整個分離純化操作過程提供厭氧環境，使用受到限制。厭養培養箱法雖然能為厭氧菌分離培養提供嚴格厭氧環境，需要特制設備，在厭氧箱中操作也不方便，由于價格昂貴，因而其應用受到一定限制。為此，為了改進厭氧細菌的分離純化方法，結合對厭氧消化器中甲烷古菌的分離與純化開放性實驗，借助Hungate除氧系統進行稀釋滾管分離，收到了很好的效果，現將有關技術介紹如下。

一、材料用具

1.接種物

取自黔南民族師范學院微生物實驗室厭氧發酵缸（厭氧消化器）底部的沉積物。

2.儀器用具

2.1Hungate除氧系統。Hungate除氧系統由高純氫氣、高純氮氣，銅柱，加熱套，不銹鋼分支管，橡皮膠管，注射器及9號針頭等組成。銅柱結構直徑30～50mm、長300～500mm的石英玻璃管，兩端加工成漏斗狀，便于連接膠管，玻璃管中裝入碎銅絲（長10～20mm，直徑0.5mm），壓緊，銅絲下面墊上玻璃纖維以防止碎銅絲散落，上端留出50mm左右的空間。銅柱外纏繞加熱帶，銅柱頂端用膠管與具有分支的不銹鋼通氣總管連接。不銹鋼總管下的各分支管用橡皮膠管連接，橡皮膠管的另一端連接1mL塑料質注射器，注射器再與9號針頭連接（圖1）。

圖1Hungate厭氧操作系統示意圖

2.2其它器具。高壓滅菌鍋，恒溫水浴鍋，恒溫培養箱，熒光顯微鏡，厭氧管（16×160mm），厭氧瓶（100mL），光波爐，3000 mL三角瓶，各種規格的注射器（1mL、2mL、5mL）等。

二、方法

1.獲取無氧N2、H2、CO2氣體

甲烷菌是嚴格厭氧微生物，都能利用H2和CO2合成CH4，一般分離甲烷菌都用H2和CO2作為營養。其分離過程需要人工保持一個無氧環境進行操作和供其生長繁殖。用于分離嚴格厭氧微生物使用的氣體雖然是高純氣體（99.999%），但仍然含有微量的O2，利用Hungate銅柱除氧系統可除掉這些微量的O2，提供和保持無氧環境。

2.銅柱除氧與還原

銅柱除氧原理：實驗使用的高純氣體（N2、H2、CO2）中含有微量的O2，當氣體經過銅柱時，這些氣體中的微量O2與Cu反應生成CuO（O2＋Cu→CuO），從而流出銅柱的氣體則為無O2氣體。

銅柱還原：銅柱使用后，里邊的Cu被氧化為CuO不能繼續與O2發生化合反應，失去除氧能力。此時，關掉其它氣體，通入H2，同時使銅柱升溫（達350℃），當H2通過高溫銅柱時，銅柱內CuO與H2反應（CuO＋H2→Cu＋H2O）生成單質Cu，CuO在加熱條件下（350℃）被H2還原為Cu，銅柱恢復除氧能力可反復使用。

操作步驟：打開Hungate銅柱除氧系統通氣橡皮管的通氣開關（止水夾），開啟H2鋼瓶，H2氣流通過銅柱，從銅柱里流出的H2用橡皮管引出室外。此時接通電熱套電源，銅柱升溫，溫度達到350℃左右，20～30min后，銅柱內的碎銅絲被H2還原，由黃黑色變為純銅錚亮色，當銅柱里面的水蒸氣被排出完全后，關閉H2鋼瓶，銅柱還原結束。

3.獲取無氧N2、H2和CO2氣體

無氧N2用于厭氧菌分離操作和培養過程中驅趕空氣，保證局部無氧環境。在銅柱還原結束后，立即打開N2鋼瓶，氣流大小控制以針頭對準操作者手背5cm距離明顯感覺到氣流為宜，并隨時注意控制氣流的大小。此時銅柱內的碎銅絲處于還原狀態的單質銅，當通入高純N2（99.999%）時，其中所含的極微量氧與單質銅反應，氧被固定下來（形成CuO），流出銅柱的則是無氧N2。利用無氧N2氣流驅趕厭氧管、血清瓶等培養容器和培養基中的空氣，以及挑菌時保證無氧環境。使用完畢后，先關緊N2鋼瓶，接著用止水夾封閉所有橡皮管。無氧H2、CO2的獲取方法操作步驟相同。

2.制備無氧培養基

2.1培養基配方（詳見表1）

表1培養基配方表[2]

注：微量元素溶液配制時先溶解氨三乙酸，NaOH調pH于6.5左右。依次溶解其它化合物，最后調pH于7.0。

3.制備方法

按照配方稱取藥品置于事先放有適量蒸餾水的三角瓶中溶解后，加入1mL的1‰刃天青液（W/V），0.4g的鹽酸半胱氨酸，用NaOH調節pH值，加足需要水量，用記號筆在三角瓶外壁標上記號，加入一定量的蒸餾水作蒸發量后，置于光波爐加熱煮沸10min后，通入無氧N2（驅趕空氣，保持培養基為無氧狀態）煮沸至培養基顏色變白后再煮10min左右進行分裝。用9號針頭連接的橡皮管，將無氧N2引入待裝培養基的厭氧管和厭氧瓶（16×160mm厭氧管、100mL厭氧瓶）洗管、瓶（用無氧N2換出瓶中空氣，使容器中無氧分子存在），用培養基分液器進行分裝，厭氧管裝4.5mL，厭氧瓶裝45mL，待裝好培養基后取出N2管塞上橡膠塞，旋緊蓋子。轉好培養基的厭氧試管用專用布袋裝好與厭氧瓶一起置121℃，0.1MPa滅菌20min待用。（厭氧瓶內的培養基使用前加入無菌無氧1%Na2S溶液0.1mL和10%NaHCO30.1mL，厭氧管內培養基使用前加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL）。

4.甲烷菌富集

用水樣取樣器取沼氣底泥5克于上述裝有45mL培養基的厭氧瓶中，利用Hungate厭氧系統，按H2/CO2體積比為40/10的比例分別加入H280mL、CO220mL，置30℃恒溫培養30天，用化學吸收法[3]檢測厭氧瓶是否有甲烷氣體產生，在甲烷菌生長對數增長中期，從產甲烷氣體的富集瓶中取樣進行滾管分離。

5.滾管分離和純化培養

5.1滾管分離培養。對檢測有甲烷菌存在的富集處理，進行第1次滾管分離。在分離培養基中補加瓊脂粉（20g/L），分裝于厭氧試管（16 mm×160mm，4.5mL培養基/管），滅菌。滅菌后置55℃水浴中保持液態，每支厭氧管中分別加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL。用1mL無菌無氧注射器取富集的樣品液0.5mL，作10-1～10-9梯度稀釋，重復3次，每支試管上下倒2～3次（注意不要產生氣泡），使樣品與培養基充分混勻并立即將稀釋管置于裝有4℃以下冰水的磁盤中迅速滾管，使培養基與樣品均勻光滑無氣泡凝固于管壁上。

將滾管分離樣品的厭氧管置于試管架上，按H2/CO2體積比為40/10的比例分別加入H240mL、CO210mL，置30℃恒溫培養30天，在管壁的培養基上有明顯的菌落出現，用化學吸收法檢測是否有甲烷氣體產生。對有甲烷氣體產生的管子，置于熒光顯微鏡下觀察菌落，對有熒光反應的菌落用記號筆畫圈作出記號，待進一步分離培養。

5.2甲烷菌純化。純化過程是多次挑取單菌落、稀釋滾管培養的過程。截取細玻璃管（內徑0.5cm、外徑0.8cm，長15cm），兩端塞上脫脂棉，在酒精燈的火焰上加熱并拉成毛細管，高溫滅菌并烘干。在無氧條件下挑菌：將有熒光反應菌落的管子置于鐵架臺上固定，打開管口，用無氧N2吹入管中，使管內保持無氧狀態。取毛細管一端與橡膠管連接（橡膠管一端用夾子封住，含在口中），另一端（2mm左右處）在酒精燈火焰上加熱并使之彎成約90℃，用它的彎頭接觸到有熒光記號的菌落，輕吸一口氣，使菌落進入毛細管，移出毛細管并快速放入有4.5mL培養基的無氧管子中，迅速塞上膠塞的同時折斷毛細管并旋上外蓋。按H2/CO2體積比為40/10的比例分別加入H240mL、CO210mL，置30℃恒溫培養30天，在管壁的培養基上有明顯的菌落出現，用化學吸收法檢測是否有甲烷氣體產生。

通過單菌落分離獲取的菌液經培養后底部有沉淀出現，用吸收法檢測管中有無甲烷氣體產生。對有甲烷氣體的菌管，用上述方法再進行2次滾管分離，則可獲得甲烷菌的純培養。挑取純培養菌落進行液體培養30d后，置4℃條件下進行保藏，同時進行鑒定。

6.甲烷菌鑒定

6.1菌落熒光反應檢測。利用產甲烷古菌在特定波長（420nm）激發下能產生特有的藍綠熒光，對分離到的樣品管進行菌落熒光反應檢測，有熒光反應的樣品管證明其有甲烷菌存在。

6.2產甲烷氣體檢測。利用甲烷菌能產生甲烷氣體的特性，將有熒光反應的樣品管用氣相色譜儀或化學吸收法進行產甲烷氣體檢測，有甲烷氣體產生的樣品管，再一次證明樣品中有甲烷菌存在。

6.3產甲烷菌純度檢測。用1mL注射器抽取有熒光反應的樣品液置熒光顯微鏡下觀察，菌體有熒光產生，物氣體雜菌，則為甲烷菌純菌，并將置常溫冰箱4℃保藏，待進一步研究或應用。

三、結果與小結

1.結果

1.1利用稀釋滾管分離法從厭氧消化器中分離獲得99支甲烷古菌純培養，經產甲烷氣體和熒光反應鑒定證明是甲烷菌（圖2）。

甲烷桿菌屬甲烷短桿菌屬甲烷球菌屬甲烷微球菌屬

Methanobacterium Methanobrevibacter Methanococcus Methanobacterium

（1000×） （1000×）（1000×）（1000×）

圖2采用稀釋滾管分離純化法得到的甲烷菌圖片

1.2甲烷菌分離純化技術流程

經上述試驗，歸納建立甲烷菌分離純化技術，其流程如下：

第一次滾管分離

第二次滾管分離

第三次滾管分離

1.3小結

采用Hungate厭氧操作系統清除氧氣徹底，操作過程能及時發現和控制無氧環境。培養基中加入對氧氣敏感的刃天青指示劑，能及時觀察操作過程的無氧狀態，使整個操作過程和培養都在無氧狀態，滿足嚴格厭氧的要求。建立的稀釋滾管分離法操作簡便、利用熒光顯微鏡觀察，菌落易于辨認，易挑取，操作過程不易污染，分離效率高等優點。只要滿足厭氧微生物的營養需求，樣品中的厭氧微生物都能分離出來。

基金項目：黔教高發[2012]426號；黔南民族師范學院微生物學重點學科[2011.6]；黔南民族師范學院教學質量工程項目院教發[2011]5號。

參考文獻：

[1]龐德公，楊紅建.產甲烷菌的分離純化培養及其培養基對于菌株的選擇作用[J]中國畜牧獸醫，2010，37(6)：32—35

[2]趙一章.產甲烷細菌及研究方法[M]成都科技大學出版社，1997182-199

[3]趙洪，鄧功成，高禮安，等.農村沼氣主要成分簡易快速測定方法[J]安徽農業科學，2008，36（20）：8766～8767