海南黃燈籠辣椒小葉病病原物的分子鑒定

鄭文虎等

摘 要 采用分子生物學技術對田間疑似植原體侵染引起的小葉癥狀的黃燈籠辣椒樣品進行檢測，以明確其病原分類地位。利用植原體通用引物對R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，對上述黃燈籠辣椒葉片DNA進行巢式PCR擴增。結果表明：獲得約1.2 kb的特異片段，經序列測定、Blast同源性檢索及進化樹和iPhyClassifier分析，獲得該特異片段長為1 248 bp，與植原體16S rⅡ組中的花生叢枝植原體（L33765）同源性最高，達99%，聚類在同一個進化枝上，相似性系數為1.00，歸屬于16S rII-A亞組。暫將其命名為黃燈籠辣椒小葉植原體（Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma，CcJLL）。

關鍵詞 黃燈籠辣椒小葉病；植原體；16S rDNA；分子鑒定

中圖分類號 S432.1 文獻標識碼 A

Molecular Identification of the Pathogen of Capsicum

chinense Jacquin Little-leaf Disease in Hainan

ZHENG Wenhu1，2， CHE Haiyan1*， YANG Yi1， CAO Xueren1， LUO Daquan1**

1 Environment and Plant ProtectionInstitute，CATAS/Key Laboratory of Integrated Pest Management on

Tropical Grops，Ministry of Agriculture，P.R.China/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control

of Tropical Agricultural Pests，Haikou，Hainan 571101， China

2 Sanya Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Sanya， Hainan 572000，China

Abstract In the paper， to ascertain taxonomic status of pathogen，Capsicum chinense Jacquin samples with little leaf symptom which were suggestive of phytoplasma infection，were detected by molecular biology. Primers R16mF2/R16mR1 and R16F2n/R16R2 were used to amplify the DNA samples from symptoms above by nested PCR. The PCR products were sequenced and Blast searching in GenBank. The phylogenetic tree and iPhyClassifier analysis of the 16S rDNA sequences showed that the sequence shared the identity of 99% with that from Peanut witches'-broom（L33765）， and clustered in the same clade， with similarity coefficient of 1.00. The phytoplasma belonged to 16S rII-A subgroup，was tentatively named as Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma，CcJLL.

Key words Capsicum chinense Jacquin little leaf disease；Phytoplasma；16S rDNA；Molecular identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.024

植原體（phytoplasma）是一類能引起植物病害的重要病原物，已在1 000余種罹病植物中檢測到該病原物，給世界各地的經濟作物造成很大損失[1]。在中國，能夠造成嚴重危害的植原體病害主要有棗瘋病、泡桐叢枝病、檳榔黃化病等[2-4]。由于植原體不能人工培養，影響了對其進行分類等方面的深入研究，但是隨著分子生物學和生物信息學的發展，其分類鑒定依據逐漸豐富起來。Lee等[5]在2000年綜合分析了植原體16S rRNA和核糖體蛋白基因的序列，形成了一個包括19個組和46個亞組植原體種類的分類體系，為后來植原體的分類打下了基礎，在植原體的分類上具有重要意義。

黃燈籠辣椒（Capsicum chinense Jacquin），又名黃帝椒、黃辣椒，是海南特有的辣椒品種，適宜在海南的東南、西南沿海地區栽培，含有豐富的辣椒素、維生素C、胡蘿卜素及多種礦物質[6]。目前，國內外相關研究者在辣椒上發現多種植原體病害，田間表現為葉片黃化、矮縮、小葉、叢枝、變葉、結果量減少及果實變小等癥狀，這些植原體屬于16S rⅠ組、16S rⅢ組，16S rⅥ組、16S r Ⅻ組等[7-11]。黃燈籠辣椒在田間常見的病害為病毒病[12-13]，其它病害的研究報道很少。筆者在田間調查過程中首次在海南省儋州市寶島新村發現了疑似被植原體侵染而表現小葉癥狀的黃燈籠辣椒樣品，本研究擬采用分子生物學和生物信息學方法對上述樣品進行檢測和分析，以明確其病原及分類地位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 3株表現典型小葉癥狀的黃燈籠辣椒樣品采自海南省儋州市寶島新村，分別編號為PH1、PH2和PH3。健康黃燈籠辣椒樣品與上述3株樣品采自同一田塊。

1.1.2 菌株和質粒 E. coli Competent Cell DH5α、克隆載體pMD18-T購自大連寶生物（TaKaRa）公司。

1.2 方法

1.2.1 植物總DNA提取 參照Lee等[14]的方法進行樣品總DNA的提取置于-20 ℃貯存。

1.2.2 植原體16S rDNA基因的巢式PCR擴增和克隆 根據Gundersen等[15]和Lee等[16]報道的引物對擴增植原體16S rDNA基因片段序列，以R16mF2/R16mR1作為第一引物對，R16F2n/R16R2作為第二引物對，進行巢式PCR擴增。引物對序列如下：

R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′；

R16mR1：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′；

R16F2n：5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′；

R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCC

CG-3′。

引物均由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

巢式PCR第一次和第二次反應體系為25 μL：ddH2O 17.3 μL， 10×Taq buffer（Mg2+）2.5 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL， DNA模板 1.0 μL， Taq DNA polymerase（5 U/μL） 0.2 μL。

巢式PCR第一次和第二次反應條件為： 94 ℃預變性3 min； 94 ℃變性1 min， 45 ℃退火1 min， 72 ℃延伸2 min， 進行5個循環； 94 ℃變性30 s，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進行25個循環；最后72 ℃延伸10 min。以健康植株總DNA為對照。

PCR 擴增產物以TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 純化回收，將目標產物與pMD18-T載體連接，轉化到感受態細胞DH5α中，利用菌落PCR反應篩選陽性克隆。

1.2.3 序列測定與分析 序列測定委托英濰捷基（上海）貿易有限公司完成。利用DNAMAN（6.0.3.99版本）分析軟件進行序列裝配；利用基因數據庫GenBank中的BLAST程序對測序結果進行同源性檢索；進化樹分析采用MEGA4.0.2，采用最大簡約法 Maximum Parsimony 分析，使用近鄰交換算法 Close-Neighbor-Interchange 完成，以 1 000為重復值進行 Bootstrap效驗；使用植原體分類鑒定的在線軟件iPhyClassifier（http：//plantpathology.ba.ars.usda.gov）對16S rDNA序列進行RFLP電子酶切。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀表現

罹病黃燈籠辣椒植株表現矮化，高度僅為健康植株的1/2左右，葉片短小叢生，葉面積不足健葉的1/5，葉脈扭曲呈疙瘩節狀，葉色略微發黃，葉肉變薄（圖1）。

2.2 PCR檢測結果

利用植原體通用引物對從表現小葉癥狀的黃燈籠辣椒葉片總DNA中擴增到大小約1.2 kb的特異片段，片段大小與Lee等[16]報道的相符，而健康黃燈籠辣椒葉片總DNA和空白對照均未出現特異擴增條帶（圖2）。

2.3 植原體16SrDNA基因片段的序列分析

將PH1、PH2和PH3樣品中擴增到的特異片段進行純化、克隆及測序。結果表明，上述3個樣品的16S rDNA擴增片段的測序結果相同，均含有1 248個核苷酸，G+C的含量為47.36%，GenBank 登錄號為JQ957928。同源性檢索發現，與該序列同源性較高的均為16S rⅡ組中的植原體16S rDNA序列，其中與花生叢枝植原體（Peanut witches-broom phytoplasma，PnWB，GenBank 登錄號：L33765）的同源性最高，達99%，將該植原體株系暫命名為黃燈籠辣椒小葉植原體（Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma，CcJLL）。

2.4 構建系統進化樹

黃燈籠辣椒小葉植原體與其它相關植原體株系構建的系統進化樹（圖3）表明，黃燈籠辣椒小葉植原體（CcJLL）與植原體16S rⅡ組成員聚類在同一個進化枝上，其中與16S rⅡ組成員PnWB（L33765）聚類在同一個小進化枝上。

2.5 計算機模擬16S rDNA-RFLP電子酶切圖譜及相似系數分析

黃燈籠辣椒小葉植原體（CcJLL）16S rDNA序列的RFLP電子酶切圖譜（圖4）分析表明，黃燈籠辣椒小葉植原體（CcJLL）與16S rⅡ-A亞組中的花生叢枝植原體（Peanut witches-broom phytoplasma，GenBank 登錄號：L33765）相似性系數為1.00，而且17種酶的電子酶切圖譜完全一致，可見黃燈籠辣椒小葉植原體（CcJLL）屬于16S rⅡ-A亞組。

3 討論與結論

本研究利用植原體通用引物對從表現小葉癥狀的辣椒葉片總DNA中擴增到植原體16S rDNA片段，該片段長1 248 bp，說明采集的樣品中存在植原體，進一步通過Blast同源性檢索及進化樹和iPhyClassifier分析確定該植原體為16SrⅡ-A亞組成員，暫將其命名為黃燈籠辣椒小葉植原體（Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma， CcJLL），這是首次在黃燈籠辣椒上發現植原體的存在。Li等[11]在陜西楊凌發現辣椒上存在辣椒叢枝植原體（Pepper witchesbroom phytoplasma），屬于16S rⅠ-B亞組成員。該植原體與本研究中發現的植原體分屬于不同的組。由于植原體至今尚不能人工培養，影響了植原體的分類研究，目前僅利用16S rDNA等少數幾個基因對植原體進行分類，存在一定的局限性。相信隨著更多的植原體全基因組序列測定的完成，將會建立更加完善的分類方法和分類體系。

黃燈籠辣椒可開發成美味的調料，也可作為醫藥工業的原料，是海南最具發展潛力的特色農作物之一。本研究的黃燈籠辣椒小葉病樣品采自海南省儋州市寶島新村，發生病害面積很小，關于該病害對黃燈籠辣椒產業的影響還有待進一步研究。鑒于黃燈籠辣椒小葉植原體與花生叢枝植原體16S rDNA基因序列間具有高度一致性，能同時在此類植物上取食的葉蟬、飛虱類昆蟲很可能是它們的共同介體，這還但有待于進一步的研究。在黃燈籠辣椒小葉病發生地也未發現其他疑似植原體感染的植物。Vladimir等[10]在墨西哥的Baja California Sur州發現表現黃化癥狀的辣椒植株，通過檢測發現，該樣品中存在16S rⅫ組植原體和2種雙生病毒的混合侵染。本研究中表現小葉癥狀的辣椒樣品是否由CcJLL單獨侵染引起，還是存在其他植原體株系以及病毒的復合侵染，還有待于進一步通過生物學和分子生物學方法進行驗證。

參考文獻

[1] 常文程， 李向東， 邵云華， 等. 棣棠叢枝病相關植原體的分子鑒定[J]. 植物病理學報， 2012， 42（5）： 541-545.

[2] 潘青華. 棗瘋病研究進展及防治措施[J]. 北京農業科學， 2002（3）： 4-8.

[3] 張春立， 林木蘭， 胡勤學， 等. 泡桐叢枝病類菌原體DNA的分子克隆與序列分析[J]. 植物學報， 1994， 36（4）： 278-282.

[4] 羅大全， 陳慕容， 葉沙冰， 等. 海南檳榔黃化病的病原鑒定研究[J]. 熱帶作物學報， 2001， 22（2）： 43-46.

[5] Lee I M， Davis R E， Gundersen-Rindal D E. Phytoplasma： phytopathogenic mollicutes[J]. Annual Review of Microbiology， 2000， 54（1）： 221-255.

[6] 高芳華， 伍壯生， 鄧長智， 等. 海南黃燈籠辣椒高產栽培技術[J]. 辣椒雜志， 2009（2）： 18-20.

[7] Castro S， Romero J. The Association of Clover proliferation phytoplasma with Stolbur disease of pepper in Spain[J]. Journal of Phytopathology， 2002， 150（1）： 25-29.

[8] Arocha Y， Pinol B， Picornell B， et al. Broad bean and sweet pepper： two new hosts associated with Candidatus Phytoplasma asteris（16S rI phytoplasma group）in Cuba[J]. Plant Pathology， 2007， 56（2）： 345.

[9] Randall J J， Bosland P W， Hanson S F. Brote Grande， a new phytoplasma associated disease of chile peppers[J]. Plant disease， 2009， 93（9）： 968.

[10] Vladimir L， Julio H G， Gerardo A A， et al. Detection of phytoplasmas in mixed infection with begomoviruses： a case study of tomato and pepper in Mexico[J]. Bulletin of Insectology， 2011， 64（Supplement）： S55-S56.

[11] Li Z N， Zhang L， Song J G， et al. Molecular detection and identification of phytoplasma associated with pepper witches' broom in China[J]. Phytoparasitica， 2013， 41（4）： 429-434.

[12] 王運勤， 王健華， 吉訓聰， 等. 海南省黃燈籠辣椒病毒病的初步調查[J]. 熱帶農業科學， 2005， 25（4）： 1-4.

[13] 王鍵華， 劉志昕， 王運勤， 等. 海南黃燈籠辣椒頂死病病原病毒的分離鑒定[J]. 熱帶作物學報， 2005， 26（3）： 96-102.

[14] Lee I M， Davis R E， Hiruki C. Genetic interrelatedness among clover proliferation mycoplasmalike organisms（MLOs） and other MLOs investigated by nucleic acid hybridization and restriction fragment length polymorphism analyses[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1991， 57（12）： 3 565-3 569.

[15] Gundersen D E， Lee I M. Ultrasensitive detection of phytoplasma by nested-PCR assays using two universal primer pairs[J]. Phytopathologia Mediterranea， 1996， 35（3）： 144-151.

[16] Lee I M， Hammond R W， Davis R E， et al. Universal amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for classification and identification of mycoplasmalike organisms[J]. Phytopathology， 1993， 83： 834-842.

責任編輯：林海妹