可可種質資源多樣性與創新利用研究進展

秦曉威等

摘 要 就可可種質資源在起源、分布、傳播、分類、鑒定及種質創新與利用等方面取得的研究進展進行綜述。可可屬植物有22種，僅可可（Theobroma cacao）和大花可可（Theobroma grandiflorum）用于栽培。可可種質資源多樣性豐富，其分類研究經歷了傳統形態學劃分的Criollo、Forastero和Trinitario遺傳類群到現代分子標記劃分的Maran～on、Curaray、Criollo、Iquitos、Nanay、Contamana、Amelonado、Purús、Nacional和Guiana遺傳類群。目前，可可的生產性品種選育仍以實生選種和芽變選種為主。分子標記的開發、遺傳連鎖圖譜的構建和全基因組測序的完成，為實現可可分子標記輔助育種提供了技術保障。

關鍵詞 可可；種質資源；種質創新

中圖分類號 S571.3 文獻標識碼 A

Advances on Germplasm Research and Utilization of

Theobroma cacao L.

QIN Xiaowei1，2，3，4， HAO Chaoyun1，2，3，4， WU Gang1，2，3， LI Fupeng1，2，3， LAI Jianxiong1*

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture，

Wanning， Hainan 571533， China

3 Danzhou Investigation & Experiment Station of Tropical Crops， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

4 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and

Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract The study explores the advances on the origin， distribution， spreading， collection， classification， identification， genetic improvement and development of cacao germplasm resources. There are approximately 22 Theobroma species， and only T. cacao and T. grandiflorum are cultivated. During the process of domestication and cultivation， abundant genetic diversity of cacao germplasm was revealed by morphological data and molecular markers. Traditionally， cacao types are classified into three main groups： Criollo， Forastero， and Trinitario. However， recent study results showed that there were 10 major groups， such as Maran～on， Curaray， Criollo， Iquitos， Nanay， Contamana， Amelonado， Purús， Nacional， and Guiana by microsatellite marker. This new classification reflects more accurately the genetic diversity. Additionally， most new cacao varieties are selected from seedlings or bud mutation. Recently， molecular markers， high-density genetic linkage map， and the whole genome sequencing have already been widely reported on cacao germplasm， which may be improved breeding efficiency by marker assisted selection.

Key words Theobroma cacao L.； Germplasm resources； Germplasm enhancement

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.033

可可為梧桐科（Sterculiaceae）可可屬（Theobroma）常綠喬木，共22種。根據花、果實和相關植物學形態特征，該屬分為Andropetalum、Glossopetalum、Oreanthes、Rhytidocarpus、Telmatocarpus、Theobroma 6組[1-2]。其中，僅可可（Theobroma cacao L.）和大花可可（Theobroma grandiflorum）被馴化為栽培物種[3]，迄今有2 000多年的栽培歷史。可可種子富黃酮類化合物、脂肪、蛋白質和膳食纖維等活性成分，具有改善心臟、腎臟、腸道功能、緩解心絞痛、促進消化、治療貧血等保健作用，是制作高級飲品、巧克力、糖果、糕點和冰淇淋等的主要原料[4-5]。目前，世界廣泛栽培的可可有Criollo（T. cacao ssp. cacao）、Forastero（T. cacao ssp. sphaeorocarpum）和Trinitario（Criollo×Forastero）3類遺傳類群[1，6]。世界可可產量的85%來源于Forastero栽培種，Criollo因其抗病性差，僅占世界產量的1%～2%[7]。另外，Motamayor等[8]鑒定補充了2類傳統的栽培品種Nacional和Amelonado，但原產于厄瓜多爾的Nacional種已基本絕跡。

可可作為重要的熱帶經濟作物，種質資源的豐富性一直備受關注。自Pound[9]首次經由厄瓜多爾到亞馬遜河流域和哥倫比亞開展抗可可叢枝病種質資源調查以來，世界可可主要栽培區陸續進行種質資源普查工作，相繼建立了10多個國家級和3個國際級種質資源保存中心[10-12]。據英國雷丁大學開發管理的國際可可種質資源數據庫（ICGD）統計，至2012年已記錄可可種質29 500份，在產量、果實、種子性狀、抗病性、配子體兼容性、株型及花結構等方面表現出豐富的遺傳變異性，但約有44%的材料重名（www.icgd.reading.ac.uk）。因此，如何快速、準確、有效地鑒定種質資源成為可可研究的核心問題。筆者就可可種質資源在起源與分布、分類與鑒定及創新利用等方面取得的研究進展進行了總結和分析，以期為其進一步研究利用提供參考。

1 可可起源、分布與傳播

1.1 可可起源與分布

可可是一種馴化時間相對較短的物種，為二倍體（2n=20）。“cacao”一詞衍生于瑪雅人納瓦特爾語“cacahuatl”。植物學家林奈根據土著人的神圣信仰，將可可樹命名為“Theobroma cacao L.”，意味著“可可——眾神的食物”。據史料記載，中美洲是世界上最早栽培可可的地區，栽培歷史超過2 000多年[1]。截至2011年，世界可可收獲面積達9.9×106 hm2，產量約4.6×106 t，其中，主產國科特迪瓦占總產量的29.4%，其次為印度尼西亞（19.1%）、加納（14.9%）、尼日利亞（10.1%）、喀麥隆（6.2%）、巴西（5.5%）和厄瓜多爾（3.1%）[13-14]。作為重要的熱帶經濟作物，過去人們依據地理起源和形態特征，將可可分為Criollo和Forastero兩大遺傳類群[15]。然而，關于可可起源與分布的假說各抒己見。以Hunter和Leake[16]為代表的“南-北散布假說”認為可可起源于南美洲亞馬遜河流域安第斯山腳下的厄瓜多爾與哥倫比亞邊界，由人為活動將Criollo種子傳播至中美洲。相反，Vavilov[17]主張的“北-南散布假說”則認為中美洲Criollo遺傳類群起源于尼加拉瓜湖的最南部，后被印第安人傳入南美洲種植[18]。而Nava[19]則主張可可具有廣泛的自然地理分布，該假說認為大量的Theobroma cacao L.群體由中美洲地區向墨西哥南部散布，受巴拿馬地峽地理隔離的影響，分化出中美洲的Theobroma cacao ssp. cacao和南美洲的Theobroma cacao ssp. sphaeorocarpum亞種；第1個亞種包含Criollo遺傳類群，第2個亞種包含Forastero遺傳類群。經典的地理隔離模型及亞種間的種間雜交試驗均能支持該假說[1-2]。

然而，許多人類學、歷史學、考古學和生物地理學的證據及遺傳群體的研究均在一定程度上支持“南-北散布假說”[20-21]。在此基礎上，Dias[22]提出可可起源與分布的新假說：在前哥倫布時期，假定亞馬遜河上游和奧里諾科河盆地存在一個相對廣泛的可可起源中心，Criollo和Forastero遺傳類群由人為活動沿著安第斯峽谷傳入中美洲。在瑪雅帝國時期，人類有意識的選擇高品質巧克力制品材料Criollo遺傳類群，而疏忽了亞馬遜Forastero群體的滅絕。Dias的新假說拓展了物種保護與遺傳改良對物種進化過程重要影響的理解。

1.2 可可種質資源的傳播

可可在世界范圍內的傳播始于西班牙殖民主義。克里斯托弗·哥倫布為尋找通往印度的航海線路，1502年到達尼加拉瓜，是首位接觸到可可的歐洲人[23]。當時，可可豆在中美洲一些地區被作為流通貨幣使用。1519年，西班牙探險家荷蘭科爾·蒂斯在墨西哥的阿茲特克帝國發現一種xocoatl飲品（巧克力飲料），于1528年帶回西班牙，并在西非一個小島上種植可可[23-24]。可可飲品在歐洲的盛行，促使西班牙、法國、荷蘭等殖民者在其殖民地如多米尼加共和國、特立尼達、海地等地區種植可可[25]。1560年，西班牙人將可可從委內瑞拉的首都卡斯卡斯引入印度尼西亞的蘇拉威西島，相繼傳入菲律賓。17世紀20年代，荷蘭人接管庫拉索島種植業，并于1778年從菲律賓引種可可至印度尼西亞和馬來西亞。17世紀60年代，法國人也將可可陸續帶到馬丁尼克島、圣盧西亞、米尼加共和國、圭亞那和格瑞納達等地區[26-27]。至1680年，馬丁尼克的加勒比海島成為主要的可可生產地之一。17世紀70年代，英國人將該作物引入牙買加。至18世紀中葉，可可由巴西北部的帕拉河引種栽培至巴伊阿。可可制品在歐洲國家市場的需求過剩，致使可可種植業持續擴張。19世紀初，可可被引至普林西比島（1822）、圣圖美（1830）和非南多波（1854）等非洲地區。此后，經由南非非南多波島傳入尼日利亞（1874）和加納（1879），又至象牙海岸（1905），該地區成為世界最大的可可生產國[27]。在喀麥隆，可可引種栽培是在1925～1939年的殖民時期[28]。中國可可引種歷史相對較短，1922年首次由印度尼西亞和爪哇地區引入臺灣嘉義、高雄等地種植[29]。20世紀50年代，中國先后從越南、泰國、馬來西亞、印度尼西亞、科摩羅、厄瓜多爾、巴西等10余個國家引進可可種質。目前，主要栽培于海南、臺灣地區，云南、廣東、廣西、福建等地也有零星引種種植[30]。

2 可可種質資源遺傳多樣性研究

2.1 表型水平多樣性

表型標記是可可種質資源遺傳多樣性研究最為原始而直觀的鑒定方法，建立一份國際規范的可可基本信息描述數據庫是遺傳信息交流、編制種質資源目錄、培育新品種、簡化管理和維持種質收集的基礎。Engels等[31]針對可可種質資源描述規范，編制了87項數量和質量性狀描述列表，該列表為國際植物遺傳資源委員會（IBPGR）可可種質描述標準的基礎[32]。同時，Engels[33]通過對其種質的花、果實和相關形態特性研究，揭示出可可種質存在Criollo與Forastero兩大類遺傳類群及其雜交種Trinitario。之后，NGoran[34]針對可可果實和種子性狀特征進行研究，證實Criollo和Forastero遺傳類群因種間遺傳雜交的發生而可繼續劃分。另外，生殖性狀，如花性狀特征因在進化過程中受較大選擇壓力的影響，在分類上表現的比營養生長更有利，是可可種質資源描述鑒定的主要特征。Enriquez和Verified曾利用花性狀對南美洲67種可可栽培種進行描述與編目，現被廣泛用來鑒定可可栽培種的變異性[35]。類似地，Bekele和Bekele[36]采用54項表型性狀描述了ICGT的100多份種質，Quiroz 和Soria[37]采用38項花、果實、種子性狀對‘Nacional種質進行鑒定。為簡化形態學標記的繁瑣指標，Dias等[38]利用多元統計方法篩選出13項表型指標對15份SIC和11份SIAL群系進行表型差異分析。Efombagn等[32]通過對喀麥隆收集保存的300份農家型種質和77份基因庫種質的表型遺傳多樣性分析，篩選出17項重要的有效描述指標。然而，由于種質的鑒定和評價是一項單調、乏味、且非常昂貴的項目，其工作的間斷性及眾多指標在實際的應用中很少被考慮、或大量的材料種植在大田等問題，使得該項的工作變得非常困難。因此，表型性狀指標的篩選與優化成為可可種質鑒定、評價的一個難點。

2.2 細胞水平多樣性

染色體標記主要包括核型、染色體帶型和原位雜交及染色體的數目和結構變異等，它們均能準確的反映植物體內出現的細胞水平多樣性。可可屬22個種中僅可可的子葉為紫色，其余均為白色子葉，這為研究可可栽培種與野生種間的系統發生關系提供依據。染色體倍性的研究結果表明，該屬所有種均為二倍體（2x=2n=20），染色體形態相似，長度變異范圍為0.5～2.0 μm[39]。然而，除可可外，可可屬其余種間和種內的遺傳多樣性幾乎沒有被評估[22]。近期，Dantas和Guerra[40]研究了可可屬中最重要的2個物種可可和大花可可有絲分裂過程中染色體的變化規律，其染色體均為對稱型核型，染色體長度變化范圍分別為1.19～2.00 μm和1.15～2.21 μm，臂率分別為1.12～1.32和1.10～1.30。此外，Couch等[41]采用復性動力學方法測得可可基因組大小變異范圍在390～415 Mb，其染色體較小，有一條次縊痕，缺乏C-帶。而Guiltinan等[42]利用熒光流式細胞術測得可可基因組大小為447 Mb±11 Mbp 2C。這些研究結果均表明，可可基因組大小與先前研究的溫帶和熱帶植物相比是很小的，這在一定程度上使得可可基因組學的某些方面研究，如全基因組測序成為可能。

2.3 分子水平多樣性

分子技術可以從根本上揭示植物內在的基因差異，為可可種質資源遺傳多樣性和準確鑒定注入了新活力。許多研究發現，與同工酶標記相比較，RAPD標記能夠產生足夠多的標記來挖掘可可種質資源的序列多態性。Sounigo等[43]利用RAPD（Random amplified polymorphic DNA）標記研究了可可主栽品種和野生近緣種的指紋圖譜，幾乎所有種質均獲得特異性譜帶，并發現可可栽培種之間的遺傳背景十分狹窄。Motamayor和Lanaud[44]利用RAPD、AFLP、SSR標記解決了Criollo、Forastero和Trinitatio可可遺傳類群的起源、分布及傳播等問題。AFLP技術在可可種質指紋圖譜研究中也進行了成功應用[45]。SSR、ISSR標記在輔助可可種質資源的收集和評估方面，體現出快速、簡單和重復性高的優點[46]。Borrone等[47]、Riju等[48]、Fouet等[49]通過EST-SSR功能性標記的開發和利用研究證實，EST-SSR標記在可可遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建以及比較基因組等研究方面有廣闊的利用前景。

分子標記已成為解決種質重復和錯誤鑒定的重要手段[50-52]。Motilal和Butler[53]的研究結果表明，基于形態學鑒定的可可種質錯誤率高達15%～44%。Figueira等[54]對11份可可種質取樣分析發現，在巴西可可種植計劃執行協會和馬來西亞巴爾種植園保存的ICS6和SIAL93是同物異名種質。馬來西亞收集的SIAL93種質來源于美國波多黎各的一種IMC67×PA218砧木枝條，因該砧木生長旺盛而被當作SIAL93接穗錯誤采集。類似情況在巴西從馬亞圭斯引種SIAL93時也發生，該材料被重新命名CEPEC533。之后，Charters和Wilkinson[55]通過ISSR分析證實SIAL93被鑒定錯誤。另外，Motamayor等[15]利用SSR標記快速矯正了23.3%的錯誤鑒定可可種質，區分了在形態學上難以鑒定的2類遺傳類群，并將952份種質劃分為Maran～on、Curaray、Criollo、Iquitos、Nanay、Contamana、Amelonado、Purús、Nacional和Guiana 10大遺傳類群，為可可種質的精準鑒定提供了有益參考。因此，分子標記的應用可澄清同物異名或同名異物材料，并為種質遺傳多樣性提供了新的見解。

3 可可種質資源創新與利用研究

3.1 可可傳統育種研究

可可種質資源創新研究主要集中在美洲大陸、加勒比、亞洲、大洋洲以及非洲等地區，受經濟發展水平等多種因素綜合影響，近幾十年來可可種質資源創新利用滯后，選育種工作未取得明顯進展。在巴西，可可種植戶通過混合篩選獲得var. Comum、var. Pará、var. Parazinho和var. Maranha～o 4個新品種。在此基礎上，巴亞州可可研究所對可可產量及構成因素的遺傳性狀進行研究，篩選出SIC、SIAL和EEG等高產品系，還發掘出一些白色籽粒的突變株，如Catongo。目前，巴西可可種植計劃委員會利用傳統雜交育種手段，獲得高產、抗叢枝病新品種Theobahia（Sca-6×ICS-1）、Theobahia 1（Sca-6×ICS-6）和Theobahia 2（Sca-6×ICS-8），但因Theobahia 1和Theobahia 2易感長喙枯萎病（Ceratocystis wilt）而被撤回。在厄瓜多爾，雖然從Nacional遺傳類群中篩選出具有獨特品質的arriba品種，但受特立尼達育種計劃的影響，Trinitario遺傳類群仍是其種質創新的主要材料[56]。近年來，馬來西亞農業種植部在可可選育種工作取得顯著成效，其UIT1×NA33和Pa7×Na33無性系具有高產、優質、高抗病等特點，平均年產量達2 500 kg/hm2，特別是Pa7×Na33品系對維管條紋回枯病具有很強的抗性。另外，巴布亞新幾內亞的Efron等[57]利用Trinitario遺傳群體，通過特異砧木篩選獲得SG2-B和SG2-S無性材料。在非洲，科特迪瓦國家農業研究中心利用Forastero和Trinitario雜交獲得新品種UF-667和UF-676，同時開展了二倍體雜交育種，但由于單倍體發生頻率低、研究費用過于昂貴而中止[43]。同時，加納、特立尼達、喀麥隆、印度尼西亞等也開展了一些可可選育種工作[27]。20世紀70年代以來，中國熱帶農業科學院香料飲料研究所利用混合篩選技術，篩選出高產、耐寒種質熱引4號，并發掘出I-H-6、I-H-18等高產、高質種質8份，現推廣種植于海南、云南、臺灣等地。

3.2 可可分子輔助育種研究

可可重要性狀的分子標記開發、高密度遺傳連鎖圖譜的構建和全基因組測序的完成為可可全基因組范圍內的分子標記輔助育種提供了技術保障[58-59]。Crouzillat等[60]利用RAPD和RFLP分子標記構建了可可的分子標記遺傳圖譜，對單株年產量及其構成因素（果實數量、果實指數、種子指數、每個果實種子數等）進行QTL定位分析，確定其在染色體上的位置及其遺傳效應。同時，Clement等[61]選用Forastero（IMC78）、Trinitario（DR1和S52）的側交后代為材料，利用RFLP、SSR、AFLP標記技術對可可籽粒性狀進行QTLs定位，共檢測到QTLs 27個，分布于1、2、4、5、9和10號染色體上。單個QTL解釋性狀表型變異的4.9%～22.3%。然而，目前大量的研究主要集中在可可抗病性的分子輔助育種研究。據統計，可可病害每年造成約81 000 t的產量損失（約占世界產量的30%），個別種植戶損失達100%[62]。因此，可可抗病性研究成為可可育種家的核心任務，而分子標記的應用為有效獲得豐富的抗病性材料提供了技術手段[12，27]。Silva和Marita分別找到了可可叢枝病抗性的RADP分子標記，有些抗性分子標記已成功的應用到抗病育種中[27]。在印度，利用AFLP分子標記和ITS序列分析已在區分可可疫霉病菌種類方面取得突破性進展[63]。另外，Brown等[64]用可可易感叢枝病品系ICS1和高抗品系Sca6為親本，以ICS1×Sca6的F2分離群體為材料，利用170個SSR標記和12個候選基因構建總長為617.9 cm分子遺傳連鎖圖譜，檢測到2個抗病QTL位點。在可可黑果病和莢果霜霉病研究方面，哥斯達尼加熱帶農業調查與教學中心利用180個SSR標記引物檢測抗黑果病品系Pound 7和抗莢果霜霉病品系UF 273雜交后代F1群體的256個單株標記基因型，獲得5個抗莢果霜霉病和3個抗黑果病的QTL位點[65]。這些研究結果表明，分子標記技術對抗病基因的準確定位，可為培育具有持久抗性的品系或品種提供新思路，在實踐和理論研究上都具有重要意義。

4 研究展望

可可種質資源作為維持其產業健康發展的源頭，深入的開展調查、收集、保存、鑒定和評價研究是提升可可種質保護、創新與利用的關鍵。但許多研究僅停留在形態學觀察、描述及簡單的分子標記分類上，與其它大宗作物相比，研究相對滯后。因此，為充分開發利用及合理保護現存的可可種質資源，其研究工作可在以下方面加以開展：

（1）加強可可種質資源的考察收集與引種研究。可可屬內有22個種，如T. cirmolinae、T. glaucum和T. mammosum等，目前僅可可和大花可可用于栽培，尚有15種具有開發應用前景。哥倫比亞、巴西、哥斯達尼加等地區分布著大量的可可自然居群和攜帶各種抗性基因的優異種質。然而，我國可可資源相當匱乏，為促進可可種質資源的創新與利用，需要加強資源的收集和優異種質的引進。

（2）建立完善的可可種質資源鑒定、評價體系。可可種質資源遺傳多樣性研究經歷了形態學、細胞學和分子水平的獨立發展階段，而這些鑒定類別之間缺乏有機的統一。甚至，鑒定結果間差異較大。盡管各種鑒定均在一定程度上體現出遺傳資源的豐富程度，但在揭示種質資源宏觀水平的表型變異在微觀分子水平上的關聯時卻缺乏直接的依據。此外，可可作為世界三大飲料作物之一，品質是決定價格和市場競爭力的關鍵因素。目前，可可種質品質評價一般根據農藝性狀和部分成分的含量來確定，尚缺乏對其功能性成分的信息物質或分子指紋、化合物結合態及功能結構等方面的精細鑒定。因此，構建一個合理的、規范的、系統的可可種質資源鑒定、評價體系亟待開展。

（3）可可種質創新利用與新品種選育工作有待進一步加強。可可是異花授粉作物，在遺傳上高度雜合，多數主產國以種子繁殖為主，F1代強烈分離，提高早期選育效率和準確鑒定目標性狀成為可可育種家關心的重要問題。利用分子標記與目標性狀間的緊密連鎖關系對性狀進行輔助選擇，為可可分子輔助育種的研究提供新的思路。基于連鎖不平衡的關聯分析一般以自然群體為材料，將目標性狀變異與基因多樣性結合，可直接鑒定出表型變異相關的基因位點或標記位點，以及對目標性狀有正向貢獻的特異等位變異。因此，在收集保存大量種質資源基礎上，利用關聯分析檢測與目標性狀顯著關聯的基因位點，發掘特異等位變異載體，可為可可重要基因克隆和分子育種提供基礎資料。

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責任編輯：沈德發