耐熱纖維素酶的研究進(jìn)展

摘要纖維素酶是糖苷水解酶的一種，它可以將纖維素物質(zhì)水解成簡(jiǎn)單糖，通過(guò)菌株發(fā)酵得到乙醇，可以解決農(nóng)業(yè)、再生能源以及環(huán)境污染等問(wèn)題。由于普通纖維素酶的低效率及高成本，很難將其大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。耐熱纖維素酶由于其耐熱性、高效率而成為現(xiàn)在纖維素酶研究的熱點(diǎn)。從耐熱纖維素酶的來(lái)源、耐熱機(jī)制、提高纖維素酶耐熱性的方法以及現(xiàn)在工業(yè)化應(yīng)用情況等方面進(jìn)行了討論，并對(duì)耐熱纖維素酶進(jìn)一步的研究、發(fā)展?jié)摿M(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞耐熱纖維素酶；耐熱機(jī)制；酶的來(lái)源；提高耐熱性；工業(yè)應(yīng)用

中圖分類(lèi)號(hào)S182文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）01-00336-03

基金項(xiàng)目泰安市科技發(fā)展計(jì)劃（201340629）；泰山學(xué)院博士科研啟動(dòng)金項(xiàng)目（Y012013001）。

作者簡(jiǎn)介彭靜靜（1983- ），女，山東泰安人，講師，博士，從事微生物基因工程和代謝工程研究，Email：zjingjing1983@163.com。

收稿日期20131203纖維素是自然界中分布最廣和含量最多的一種結(jié)構(gòu)多糖。植物每年通過(guò)光合作用能產(chǎn)生大量的纖維素類(lèi)物質(zhì)，各種植物殘?bào)w中都含有大量的纖維素，目前大部分用于燃燒或者廢棄，不但污染環(huán)境而且造成了很大的資源浪費(fèi)。而與之相矛盾的卻是人類(lèi)所面臨的能源問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，因此纖維素的開(kāi)發(fā)與轉(zhuǎn)化在這種情況下應(yīng)運(yùn)而生。而纖維素物質(zhì)可水解成單糖進(jìn)而發(fā)酵生成乙醇、氫氣等可再生能源。纖維素酶作為纖維素降解與轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，得到了人們的關(guān)注。耐熱性纖維素酶因其耐熱特性而具有減少雜菌的污染、加快反應(yīng)速度、簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)，人們對(duì)耐熱纖維素酶的各個(gè)方面進(jìn)行了廣泛深入的研究，且一直致力于開(kāi)發(fā)應(yīng)用，成為如今纖維素資源轉(zhuǎn)化、降解纖維素的重點(diǎn)內(nèi)容[1]。

1耐熱纖維素酶的開(kāi)發(fā)潛力

耐熱性纖維素酶因其耐熱性在生產(chǎn)中具有實(shí)用價(jià)值，可簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程，減少雜菌的污染，高溫下可加快降解速度，減少生產(chǎn)成本等[1-2]，目前對(duì)其的應(yīng)用已初具規(guī)模。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，纖維素酶必將在食品、飼料、環(huán)境保護(hù)、工業(yè)生產(chǎn)等方面挖掘出更大的潛力。目前人們更加關(guān)注的是耐熱纖維素酶在纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇方面的開(kāi)發(fā)，因?yàn)槿祟?lèi)急需達(dá)到可再生資源乙醇代替石油這一愿望。木質(zhì)纖維的降解利用過(guò)程中，結(jié)晶態(tài)纖維素的水解是主要瓶頸。纖維素酶的研究在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有大量的成果積累。纖維素發(fā)酵獲得生物乙醇的研究受到了世界各國(guó)政府和研究機(jī)構(gòu)的一直以來(lái)的高度關(guān)注，有著無(wú)可比擬的市場(chǎng)和工業(yè)潛力。

2耐熱纖維素酶的工業(yè)化應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1食品發(fā)酵工業(yè)食品發(fā)酵工業(yè)是耐熱纖維素酶現(xiàn)階段應(yīng)用最廣泛的一個(gè)領(lǐng)域[3]。在進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)添加適合的耐熱纖維素酶可顯著提高酒精的出酒率及原料的利用率，源自于纖維素酶的β1，3和β1，4能幫助大麥發(fā)芽，縮短發(fā)酵時(shí)間，而且酒的口感醇香[4]。在淀粉制造時(shí)，加入的纖維素酶可起到協(xié)同作用，縮短生產(chǎn)時(shí)間，增加產(chǎn)率；用大豆生產(chǎn)蛋白質(zhì)時(shí)加入纖維素酶，因消化細(xì)胞壁可促使脫去豆衣，加快浸泡效率，增加蛋白質(zhì)的得率；在果汁加工和橄欖油的提取中， 可促進(jìn)汁液的獲得和澄清；在罐頭生產(chǎn)中加入纖維素酶可提高透明度，且風(fēng)味好；在醬油的釀造中，纖維素酶可促進(jìn)大豆的細(xì)胞壁水解、細(xì)胞膜膨脹軟化，使包藏在細(xì)胞中的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放，明顯提高了醬油質(zhì)量、縮短了生產(chǎn)周期[5]。諸如此類(lèi)的優(yōu)點(diǎn)使耐熱纖維素酶的應(yīng)用早已擴(kuò)展到醫(yī)藥、日用化工、煙草、廢水處理等行業(yè)。

2.2原料生產(chǎn)中的應(yīng)用農(nóng)副產(chǎn)品和城市廢料中的纖維素，通過(guò)纖維素酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖和單細(xì)胞蛋白，對(duì)人類(lèi)有著很大的利用價(jià)值。耐熱纖維素酶在罐頭生產(chǎn)、茶葉加工、海藻中提取瓊脂中作為原料加入，明顯提高了產(chǎn)品的品質(zhì)[6]。

2.3飼料工業(yè)制備低纖維飼料時(shí)，耐熱纖維素酶能轉(zhuǎn)化粗飼料如麥秸、殘木、麥糠、稻草、玉米芯等，把其中一部分粗纖維素轉(zhuǎn)化為單體糖、小分子蛋白、低脂肪等，降低飼料中粗纖維含量，把大分子降解為更易消化的小分子物質(zhì)；其次，在制取飼料酶制劑、植物纖維原料降解中的作用也不容忽視。

2.4其他用途纖維素酶最成功、量最大的應(yīng)用是在工業(yè)（首屬紡織業(yè)）上，諸如牛仔布的水洗整理（拋光處理）應(yīng)用當(dāng)屬典型。在醫(yī)藥方面，纖維素酶與淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶有一樣的功效，可作為消化劑使用（因人類(lèi)每天有大量的纖維素?cái)z入），有報(bào)道稱(chēng)某些發(fā)達(dá)國(guó)家已有含纖維素酶的消化劑出售。在遺傳工程方面，纖維素酶可用來(lái)去除植物、微生物的細(xì)胞壁，進(jìn)行不同物種間細(xì)胞融合以達(dá)到農(nóng)作物、微生物雜交育種的目的，解決了遠(yuǎn)源雜交不親和的難題。在環(huán)保方面，纖維素酶可加速日常生活產(chǎn)生的污物降解，或把纖維素酶添加入清洗劑（如餐洗凈、洗衣粉）中，亦可增加清洗劑的效果。在造紙業(yè)方面，用耐熱纖維素酶處理熱紙漿，進(jìn)行毛邊處理，可提高紙的品質(zhì)。其他很多方面的應(yīng)用還有很多，不再一一列舉。

3耐熱纖維素酶的研究現(xiàn)狀

3.1耐熱纖維素酶的產(chǎn)生菌至今，研究者們對(duì)耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌進(jìn)行了廣泛研究，實(shí)驗(yàn)用菌大多來(lái)源于研究者們的自然篩選，如從溫泉、活火山口附近。或者經(jīng)過(guò)人工選擇，將自然突變的耐高溫菌從自然界中選擇出來(lái)。人們對(duì)耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌進(jìn)行了廣泛研究，純化的耐熱纖維素酶的微生物有：多節(jié)閃爍桿菌（Fervidobacterium nodosum）[7]，克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）[8]，極端嗜熱球古菌（Pyrococcus horikoshii）[9]，解纖維熱酸菌 （Acidothermus cellulolyticus）[10]，熱纖維素梭菌（Clostridium thermocellum）[11]，海洋紅嗜熱鹽菌（Rhodothermus marinus）[12]，酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）[13]，枯草桿菌（Bacillus subtilis）[14]，海棲熱袍菌（Thermotoga maritime）[15]，新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana）[16]，強(qiáng)烈熾熱球菌（Pyrococcus furiosus）[17]，嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）[18]，超嗜熱菌（Aquifex aeolicus）[19]等。

3.2耐熱纖維素酶的特性不同的酶各有其不同的生理結(jié)構(gòu)和酶活性質(zhì)、條件，即使是同一種酶在不同的條件下也可能有不同的特性，至今被研究者們研究的酶很多，如極端嗜熱古菌產(chǎn)生的纖維素酶對(duì)CMC底物有活性，105 ℃和3.0分別是其最適反應(yīng)溫度和pH。云南師范大學(xué)的課題組曾在2009年從云南大馬尖山土壤中篩選到一株耐熱纖維素酶產(chǎn)生菌D9，該菌適合在pH 6.0、70 ℃的條件下發(fā)酵，產(chǎn)生的纖維素酶最適反應(yīng)溫度和pH分別為70 ℃和6.0，在65 ℃保溫1.1 h后殘余酶活力為96%。來(lái)源枯草桿菌的纖維素酶在75 ℃條件下保溫30 min殘存的酶活性還可以達(dá)到70%。從隱球酵母中純化的胞外纖維素酶主要是對(duì)CMC底物的水解作用，對(duì)不溶性底物如結(jié)晶纖維素的降解能力低于對(duì)CMC底物的降解。常州工學(xué)院的賀蕓從高溫堆肥中分離得到一株嗜熱脂肪芽孢桿菌，它能產(chǎn)生胞外纖維素酶，酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別是66 ℃和7.0；而云南大學(xué)微生物研究所課題組同樣從西雙版納溫泉水樣中分離到了嗜熱脂肪芽孢桿菌的CC22菌株產(chǎn)生的酶最適反應(yīng)溫度和pH分別是75 ℃和7.2。來(lái)源嗜熱菌（Pyrococcus horikoshii）的內(nèi)切葡聚糖酶具有很強(qiáng)的水解結(jié)晶纖維素的能力[1]。表1列舉了部分微生物來(lái)源的耐熱纖維素酶特性。

3.3環(huán)境因素對(duì)嗜熱酶熱穩(wěn)定性的影響大多數(shù)耐熱纖維素酶有其固有的熱穩(wěn)定性，而一些產(chǎn)耐熱纖維素酶菌胞內(nèi)酶則通過(guò)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境（鹽離子濃度、底物、分子伴侶、壓力、輔酶）來(lái)提高酶的耐熱性。①離子影響。與其他離子相比，鉀離子、鈣離子、硫酸根離子、銨根離子、磷酸氫根離子通過(guò)影響水分子作用，和相鄰殘基形成離子鍵、配位鍵起到類(lèi)似二硫鍵的橋接作用，從而穩(wěn)定酶分子的三維結(jié)構(gòu)。其中鈣離子的總用是最明顯的，也是研究最多的：在鈣離子存在的條件下，幾乎一半以上的堿性蛋白酶能在65 ℃的條件下維持15 min。耐高溫中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性更加依賴(lài)于鈣離子。有位學(xué)者曾經(jīng)的研究：從云南西雙版納分離篩選的菌號(hào)為HY69的耐熱菌株產(chǎn)生的含鈣蛋白酶特別耐熱，最適活性溫度為87 ℃，且81 ℃保溫3.1 h 仍保持64%的活性。如用透析法完全除去該酶中的鈣離子，81 ℃保溫11 min就完全喪失活性。②底物分子總用。某些底物分子也可以通過(guò)穩(wěn)定酶分子的活性位點(diǎn)來(lái)使其適應(yīng)高溫環(huán)境。③分子伴侶。當(dāng)環(huán)境溫度接近胞內(nèi)酶的變性溫度時(shí)，分子伴侶通過(guò)重新折疊來(lái)保護(hù)耐熱纖維素酶的活性。④此外，應(yīng)用超高壓（50 MPa以上）也可使酶結(jié)構(gòu)緊湊，疏水作用更穩(wěn)定；輔酶和某些熱穩(wěn)定因子（甘油、乙二醇、環(huán)多磷酸鹽等）也是不可缺少的因素。熱穩(wěn)定因子的作用很大，最常見(jiàn)的如甘油、蔗糖及乙二醇溶液。不同的纖維素酶耐熱機(jī)制不同，存在明顯的復(fù)雜性，對(duì)某一特定的酶而言，不同的耐熱機(jī)制所起的作用也不同，有的耐熱機(jī)制單一，有的則是幾種因素共同作用的結(jié)果。這些因素也為增加纖維素酶的耐熱性提供了參考。

3.4耐熱纖維素酶酶活測(cè)定方法

3.4.1傳統(tǒng)纖維素酶測(cè)定方法。纖維素酶是由多種酶組成的，因各自的底物專(zhuān)一性及降解產(chǎn)物不同，故檢測(cè)方法也是視具體情況而定。大多數(shù)時(shí)候，應(yīng)用較多的是測(cè)定纖維素酶系總的糖化能力，如挑選某高產(chǎn)菌株，此菌株能產(chǎn)生纖維素酶系，完全有能力獨(dú)自徹底降解纖維素。可以利用的方法有濾紙酶活測(cè)定方法、熒光法。原理都是測(cè)定纖維素降解生成的小分子糖的量來(lái)表征活性。在科學(xué)試驗(yàn)中，研究者們只會(huì)專(zhuān)門(mén)研究有一種酶活性的纖維素酶，故其酶活測(cè)定方法也是特定的方法，如發(fā)展起來(lái)的內(nèi)切葡萄糖苷酶測(cè)定方法有羧甲基纖維素Na并結(jié)合DNS法顯色，測(cè)定還原糖的量來(lái)表征酶活。再如外切葡糖苷酶活的測(cè)定用的較多的是微晶纖維素酶活測(cè)定方法和棉花糖化法，也要結(jié)合DNS顯色法。而葡糖苷酶活測(cè)定卻是以水楊苷作底物，用4氨基安替比林顯色，結(jié)合分光光度法測(cè)定，也可用熒光法（利用熒光物質(zhì)與降解底物結(jié)合后在測(cè)熒光度）。當(dāng)然還有其他的方法，但都是利用化學(xué)反應(yīng)而進(jìn)行間接的估量，誤差是絕對(duì)的，還有待更先進(jìn)的、直接、方便的方法研發(fā)出來(lái)[20]。

3.4.2傳感器檢測(cè)方法。生物傳感器是綜合了生命科學(xué)、信息科學(xué)、電子技術(shù)的交叉學(xué)科，生物傳感器誕生于1962年，全面展開(kāi)是在20世紀(jì)80年代。30多年來(lái)，生物傳感器的類(lèi)型與應(yīng)用也越來(lái)越多，壓電生物傳感器（ piezoelectric biosensors）是個(gè)典型。它主要是利用壓電石英諧振器對(duì)質(zhì)量的敏感性，通過(guò)監(jiān)測(cè)諧振器吸附待測(cè)物后頻率的變化來(lái)檢測(cè)待測(cè)物。其次，電化學(xué)酶?jìng)鞲衅饕矐?yīng)用較多，主要由2部分組成：固定化酶膜和電極。固定化酶膜可以選擇性“識(shí)別”被檢測(cè)的物質(zhì)，并且催化被“識(shí)別”出的物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，電極則把這一催化反應(yīng)中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，進(jìn)而通過(guò)儀表顯示出來(lái)。傳感器方便、快捷，但技術(shù)很不成熟，仍需繼續(xù)研發(fā)。

4小結(jié)與展望

纖維素酶具有非常廣泛的應(yīng)用前景，纖維素酶不但在食品、發(fā)酵、紡織、飼料等工業(yè)方面有很大的應(yīng)用潛力，還可應(yīng)用于造紙、醫(yī)藥保健、石油開(kāi)采、新型能源、環(huán)保以及用于洗滌劑等行業(yè)，耐熱纖維素酶由于其無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)更受到人們的關(guān)注。目前只有少數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家擁有纖維素酶的生產(chǎn)及應(yīng)用技術(shù)，產(chǎn)品的壟斷造成市場(chǎng)價(jià)格居高不下。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)廠家少、生產(chǎn)規(guī)模小，應(yīng)用技術(shù)尚需進(jìn)一步攻關(guān)，產(chǎn)品供應(yīng)以進(jìn)口為主，供需矛盾較大。通過(guò)傳統(tǒng)的篩選人工突變或自然突變的耐熱纖維素酶產(chǎn)生菌和基因工程技術(shù)改造基因可以較大幅度地提高纖維素酶的耐熱性，還可以通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化和發(fā)酵過(guò)程工藝，如采用固體發(fā)酵來(lái)增加纖維素酶高溫下的穩(wěn)定性。這些方法雖取得了一定成效，但仍達(dá)不到工業(yè)要求。徹底地解決問(wèn)題還需深入研究纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)揮的關(guān)系以及作用方式，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行有效改造，從根源上解決問(wèn)題；或者通過(guò)篩選新的產(chǎn)極高溫纖維素酶菌種，發(fā)現(xiàn)具有開(kāi)發(fā)潛力的新酶源，因其天然性穩(wěn)定性會(huì)更高。總之，纖維素酶是目前多糖水解酶類(lèi)中少數(shù)幾個(gè)尚有大量亟待解決問(wèn)題的酶，卻是有著無(wú)可比擬的市場(chǎng)和工業(yè)潛力的酶。下一步的重點(diǎn)會(huì)在分子水平上進(jìn)一步闡明纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能，研究耐熱纖維素酶的基因表達(dá)與調(diào)控的關(guān)系；針對(duì)不同工業(yè)需要研制各自適用的耐熱纖維素酶；擴(kuò)大現(xiàn)有耐熱纖維素酶的耐熱限度。同時(shí)，加大科學(xué)研究成果的實(shí)際應(yīng)用也是必不可少的。

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