不同檢疫處理方法對常州地區擬出口花木介質土中真菌的處理效果比較

王麗萍 陳文俊 鄭安明 李東明

摘要[目的]比較不同檢疫處理方法對常州地區擬出口花木介質土中真菌的處理效果。[方法]以常州嘉澤鎮花木種植基地的介質土為材料，對樣本中的真菌種群進行分離、鑒定和分析，并研究熱處理、微波輻射、熏蒸處理3種不同檢疫處理方法對土壤微生物的抑制效果。[結果]從該地區的花木土壤中分離、純化和鑒定到包括青霉屬（Penicillium）等的17屬58種真菌；60、80、100 ℃的熱處理能較好地殺死或滅活介質土中的微生物；微波處理和熏蒸處理對土壤微生物有明顯抑制效果。[結論]利用較高溫度處理土壤（100 ℃）、長時間的微波輻射和密閉熏蒸是較好的土壤處理方法。

關鍵詞介質土；真菌；鑒定；檢疫處理

中圖分類號S184文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）01-00080-03

作者簡介王麗萍（1986-），女，江蘇常州人，農藝師，碩士，從事植物檢疫研究，Email：wlpsbc@126.com。

收稿日期20130903花卉苗木業是目前世界農業最具活力的產業之一，全球年貿易額高達2 000億美元，并以每年10%的速度遞增。以嘉澤為代表的常州花卉苗木業2005年突破30億元，農民人均收入達到8 000多元，目前產區總面積達21 333 hm2，年銷售額超60億元。隨著第八屆中國花博會在常州武進的順利舉行，常州花木“向外走”的呼聲也越來越高。但除了在2007年向美國出口過一批12 000株的紅葉石楠外，幾乎沒有出口。花木出口最大的障礙在于國外檢疫機構對我國出口的花木尤其是攜帶的介質土設置了嚴格的檢疫要求。如何對介質土進行科學的檢疫處理，使其達到國外所規定的相關檢疫要求，破除花木出口的貿易壁壘，是急需解決的問題。為此，筆者對常州嘉澤鎮花木種植基地土壤中的真菌群落進行了初步分離和鑒定，分析了花木基地的土壤真菌群落結構，并研究了熱處理、微波輻射、熏蒸處理3種不同檢疫處理方法對土壤微生物的抑制效果，以期為花木出口企業進行檢疫處理、土壤管理、栽培管理提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1供試土壤。試驗土壤于2013年5月采自常州嘉澤花木基地。取5～15 cm層的土樣，置于冰盒，帶回常州出入境檢驗檢疫局有害生物實驗室進行真菌分離、高溫處理、微波輻射、熏蒸等處理。

1.1.2培養基和培養液。PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 ml，高溫高壓滅菌。土壤浸漬培養基：1 000 g土壤浸于1 000 ml水，充分混勻后1∶5對水加入蔗糖10 g做成1 L營養液和瓊脂培養基。土壤搖菌培養液：1 000 g土壤浸于1 000 ml水，充分混勻后1∶5對水加入蔗糖10 g做成1 L營養液。

1.1.3試劑。DNA提取、ITS引物合成、PCR等分子生物學常用試劑購于上海生工生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1 土壤真菌的分離和鑒定。將同一地區采集的土樣混合均勻，過直徑為2 mm的篩，將較大土塊和植被的枝葉篩掉，共取10 kg，置于100 ml無菌水中30 ℃、200 r/min懸浮30 min，用稀釋平板分離法[1]進行土壤真菌分離。將單胞稀釋分離出的菌落培養于PDA培養基48 h后，進行形態學等的觀察和DNA提取，DNA提取參考劉少華等[2]的方法。PCR反應體系（總體積為50 μl）：0.2 mmol/L dNTPs，0.5 mmol/L ITS1和ITS4引物，2.0 mmol/L Mg2+，1 U Taq酶，10倍緩沖液5 μl，DNA 10 ng左右。PCR循環：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃再延伸10 min。DNA測序服務由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2.2 土壤熱處理。在常壓下，將已預處理的介質土在60、80、100 ℃條件下分別處理2、4、8 h，以不處理作為空白對照。然后取處理好的土壤1 g，加入裝有培養液的三角瓶中，30 ℃振蕩培養，分別培養6、12、24 h后再取培養液放入分光光度計中測定OD600，以培養0 h的樣品為對照。

1.2.3 介質土無害化微波處理。在常溫常壓狀態下，將已預處理的介質土放在2 450 MHz頻率的微波條件下分別處理1、2、5 min，以不處理作為空白對照。然后取處理好的土壤1 g，加入裝有培養液的三角瓶中，30 ℃振蕩培養，分別培養6、12、24 h后再取培養液放入分光光度計中測定OD600，以培養0 h的樣品為對照。

1.2.4 介質土無害化熏蒸劑處理。在常溫常壓狀態下，用含量不低于98%的溴甲烷氣體分別處理介質土6、12、24 h，劑量為240 g/m3，以不處理作為空白對照。介質土厚度不超過30 cm，處理后充分散氣。取處理好的土壤1 g，加入裝有培養液的三角瓶中，30 ℃振蕩培養，分別培養6、12、24 h后再取培養液放入分光光度計中測定OD600，以培養0 h的樣品為對照。

2 結果與分析

2.1 花木基地土壤真菌的種群組成通過對常州嘉澤花木基地土壤樣品中的真菌分離和純化，共鑒定出17個屬58個種真菌，分別是：青霉屬（Penicillium）15個種，木霉屬（Ttrichoderma）8個種，曲霉屬（Aspergillus）7個種，鐮孢屬（Fusarium）5個種，毛霉屬（Mucor）4個種，枝頂孢屬（Acremonium）3個種；枝孢菌屬（Cladosporium）、疫霉屬（Phytophthora）、毛殼菌屬（Chaetomium）、被孢霉屬（Mortierella）、粘帚霉屬（Gliocladium）各2個種，金孢屬（Chrysoporium）、腐質霉（Humicola）、輪枝菌屬（Vertillium）、漆斑菌屬（Myrothecium） 、莖點霉屬（Phoma）和絲核菌屬（Rhizoctonia）各1個種。其中，青霉屬、木霉屬、曲霉屬、鐮孢屬在該花木基地土壤中的種類、數量較多，分別占菌株總數的25.86%、13.79%、12.07%和8.62%，是該基地土壤的優勢真菌菌群。

2.2土壤熱處理對土壤微生物的影響由圖1～圖3可知，60 ℃不同時間處理的土壤微生物在6～12 h生長不明顯，24 h后與0 h比較生長顯著，但明顯慢于未處理對照；80 ℃不同時間處理的土壤微生物在0～6 h生長不明顯，12 h后與0～6 h比較生長顯著，但明顯慢于未處理對照；100 ℃處理后的土壤微生物基本不生長，與0 h比較生長不顯著，未處理對照生長量顯著。

對土壤的消毒處理措施較多，該研究選取了簡單、快捷、易行的幾種措施，都取得較好的效果，其中利用較高溫度處理土壤（100 ℃）、長時間的微波輻射和密閉熏蒸是較好的土壤處理方法，對土壤微生物的抑制效果非常顯著。在高溫作用下，許多病原菌會被直接殺死，如白菜軟腐病菌在50.0 ℃下10 min即死亡、油菜菌核病的菌核在50.0 ℃下5 min即死亡、根結線蟲在47.5 ℃下15 min即死亡等。短時間或長時間的熱處理使土壤深層溫度達到一定高度，對殺死土壤中的病原菌作用較大。馮忠民等闡述了利用太陽能熱處理土壤來治理連作障礙的原理[4]。微波輻射也是直接殺死微生物的有效措施，不僅利用在土壤殺菌技術上，在土壤或生態環境的修復等方面也應用廣泛。微波輻射殺死了土壤中的微生物，對土壤的有機質含量、pH變化產生影響，從而影響土壤肥力[5]。土壤熏蒸是設施栽培很好的土壤消毒處理方法，能有效緩解土壤的鹽漬化、連作障礙等。根據《蒙特利爾議定書哥本哈根修正案》的相關規定，我國作為發展中國家，將在2015年禁用溴甲烷等對臭氧消耗嚴重的物質[6]，新型高效土壤消毒劑有待研發。張騰等研究了1，3二氯丙烯、二甲基二硫、威百畝、甲酸甲酯4種熏蒸劑對土壤微生物的影響，其中甲酸甲酯和二甲基二硫在影響微生物數量及微生物生物量氮方面效果明顯[7]。

該試驗的熱處理、微波處理和熏蒸處理結果有助于指導花木出口企業采取正確的檢疫處理措施，使土壤中病原菌數目下降到不至于引起作物病害造成檢疫風險或經濟損失的程度。微波處理效果顯著，無公害，但前期投入較大，使用成本較高，相信隨著技術的改良和普及會成為一種重要的檢疫處理方法；熏蒸處理法作為一種傳統的檢疫處理方法，效果明顯，但隨著溴甲烷等熏蒸劑的禁用，目前已不適宜繼續推廣；熱處理簡單實用，無污染，適合在具備熱處倉的企業或口岸進行推廣。

參考文獻

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[2] 劉少華，陸金萍，朱瑞良，等.一種快速簡便的植物病原真菌基因組DNA提取方法[J].植物病理學報，2005，35（4）：362-365.

[3] 趙風艷，吳鳳芝，劉德，等.大棚菜地土壤理化特性的研究[J].土壤肥料，2000（2）：11-13.

[4] 馮忠民.陳云槐.徐欽輝，等.利用太陽能熱處理治理連作障礙[C]//植物保護與農產品質量安全論文集.北京：中國農業科技出版社，2008：152-154.

[5] 趙永富，鄭正，袁守軍，等.施用輻照處理污泥對觀賞植物生長的影響[J].安徽農業大學學報，2005，32（1）：36-40.

[6] UNEP MBTOC.Report of the methyl bromide technical options committee[M].Nairobi：UNEP，2002：43-60.

[7] 張騰，燕平梅，李園，等.4種熏蒸劑對土壤微生物特性的影響[J].中國農學通報，2013，29（3）：116-120.