2種不同啟動子驅動下1—SST基因轉化甘蔗的抗旱性比較

武媛麗等

摘 要 將從菊芋中克隆到的蔗糖：蔗糖-1-果糖基轉移酶基因（即1-SST基因），與根部特異性表達啟動子pPST2a組合，通過農桿菌介導法獲得轉pPST2a：1-SST基因甘蔗植株，通過分子檢測共得到15個陽性轉基因株系。將前期工作得到的轉rbcs：1-SST基因甘蔗5個株系與轉pPST2a：1-SST基因甘蔗進行抗旱性比較。結果發現，轉pPST2a：1-SST基因甘蔗的抗旱性高于轉rbcs：1-SST基因甘蔗。與啟動子rbcs相比，啟動子pPST2a能夠更大程度上增強轉1-SST基因甘蔗植株的抗旱性。

關鍵詞 果聚糖；1-SST；轉基因甘蔗；抗旱性比較

中國分類號 S59；Q812 文獻標識碼 A

Drought Resistance of the Transformed Sugarcanes with

1-SST Gene Driven by Two Different Promoters

WU Yuanli，ZHANG Shuzhen，LI Xiaojun，CAI Wenwei，YANG Benpeng*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/

Sugarcane ResearchCenter， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology

and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Fructan is a nonreducing polysaccharides of glucose that functions as a protectant in the stabilization of biological structures and enhances the stress tolerance under abiotic stresses in organisms. The sucrose：sucrse 1-fructosyltransferase（1-SST） gene from Jerusalem artichoke combined with root specific promoter pPST2a was transferred into sugarcane（Saccharumofficinarum L.）using Agrobatorium-mediated method. Results indicated that 15 pPST2a：1-SST transgenic lines were successfully obtained according to molecular detection. Compared the drought resistance of the transgenic sugarcane between the one with pPST2a：1-SST lines obtained in the study and the other one with rbcs：1-SST obtained in previous research. The resuults showed that drought resistance of the transgenic sugarcane with pPST2a：1-SST lines was better than the one with rbcs：1-SST. And it revealed that promoter pPST2a could make drought resistance of transgenic sugarcane even stronger than the promoter rbcs.

Key words Fructan；1-SST；Transgenic sugarcane；Comparison of drought resistance

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.001

甘蔗是世界上最為重要的糖料作物，也是理想的可再生能源作物。甘蔗食糖占中國食糖總量的90%以上[1]。干旱是最為常見的非生物脅迫之一，植物對于干旱的敏感性表現在因水分缺失而導致的滲透脅迫。目前，有80%以上的糖料甘蔗種植在缺乏灌溉條件的旱坡地。干旱嚴重影響糖料甘蔗的產量，已成為影響甘蔗生產范圍最廣、頻率最高、損失最為嚴重的自然災害之一。

植物對于干旱的敏感性之一，即表現在因水分缺失而導致滲透脅迫。植物在長期的進化過程中產生多種機制來適應這種逆境脅迫，如積累季胺類（甜菜堿）、氨基酸類（脯氨酸）、糖類（海藻糖、果聚糖、山梨糖醇）等[2-3]滲透調節物質。國內外很多研究證明，將微生物中編碼高聚合度（degree of polymers， DP）果糖的果糖基轉移酶基因（SacB基因）轉入煙草（Nicotiana tobacum）、番茄（Lycopersicon esculentum）、甜菜（Beta vulgaris）、小麥（Triticum aestivum）后， 植株的耐旱性和耐鹽性[4-8]均得到明顯的提高。而由1-SST基因編碼的蔗糖： 蔗糖-1-果糖基轉移酶合成的低聚合度（DP=3）果聚糖對植物抗旱性改良的相關報道較少。李慧娟等[9]將1-SST轉入模式植物煙草中，使煙草的抗旱性得到了明顯的提高。葉興國等[10]將1-SST基因轉入小麥中，發現在水分脅迫處理前15 d內果聚糖積累量較低，水分脅迫21～28 d果聚糖開始積累，隨著復水后干旱脅迫解除，果聚糖含量下降，低聚果糖的有效積累可提高小麥的抗旱能力。

目前，已獲得的5個轉rbcs：1-SST基因甘蔗株系被證實具有合成低聚果糖的能力并且該植株的抗旱性得到明顯的提高。植物根部在抗旱及耐鹽性上有重要的作用。因此，用根部特異性表達啟動子pPST2a[11]替換原來的組成型表達的rbcs啟動子。本研究分析轉pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的干旱及鹽脅迫影響，并將前期工作得到的轉rbcs：1-SST基因甘蔗5個株系與pPST2a：1-SST基因甘蔗進行抗旱性比較，以期了解2種不同啟動子作用下，轉1-SST基因甘蔗的抗旱性差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 轉rbcs：1-SST基因甘蔗株系T0代由本實驗室試驗田保存；抗性植株T0代幼苗由本實驗室人工氣候箱中保存。

1.1.2 供試試劑 PCR試劑購自寶生物公司，PCR引物合成及基因測序均由上海生工生物工程公司完成。其它常用的化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 試驗儀器 瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一儀器廠），德國Biometra T1 PCR儀，凝膠成像系統（BIO-RAD），Eppendorf PCR儀。電導率儀，超凈工作臺，人工氣候箱等儀器設備均由熱帶生物技術研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 轉pPST2a：1-SST基因甘蔗植株的獲得 取抗性植株葉片，用SDS法小量提取其總DNA進行1-SST基因的PCR檢測。檢測引物： F1：5′-ACACAAACGGGCTGGACAT-3′，F2：5′-CATTTCC

CTACGCTTACATCCT-3′。擴增產物為1-SST基因中約750 bp片段。程序如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5個循環；94 ℃10 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min，20 ℃保存。其中以含目的基因的重組質粒DNA作正對照，以未轉化甘蔗的DNA為負對照，PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析并照相。

1.2.2 轉pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的干旱及鹽脅迫試驗 轉pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗模擬干旱及干旱脅迫：將轉pPST2a：1-SST基因植株隨機選出8株和2株未經遺傳轉化的對照植株分為2組，每一組包括4個轉基因植株和1個對照植株。一組培養在同一瓶含15% PEG6000的MS培養基中，模擬干旱脅迫。另一組培養在同一瓶吸足水分的保水劑中，此后不再供水，逐漸形成干旱環境，分別培養1個月后觀察實驗結果。

轉pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗鹽脅迫：將轉pPST2a：1-SST基因的植株隨機選出4株和1株未經轉化的對照植株同時培養在200 mmol/L NaCl的MS培養基中，進行耐鹽性測試，培養1個月后觀察實驗結果。

1.2.3 轉pPST2a：1-SST基因甘蔗與轉rbcs：1-SST基因甘蔗抗旱性的比較 分別將2種不同啟動子的轉基因甘蔗和未經遺傳轉化的甘蔗莖稈分別砍成大小相似的帶芽莖段，種植到花盆中，6～7片葉齡后進行干旱脅迫，觀察植株的萎蔫情況。取上述轉rbcs：1-SST基因的甘蔗株系和轉pPST2a：1-SST基因甘蔗株系以及未轉化植株作為實驗材料，檢測這些植株的抗旱相關的生理生化指標。取相同部位的葉片進行測定，生理生化指標包括SOD（超氧化物歧化酶）活性、離體葉片保水率、葉片質膜透性（即相對電導率）[12]等。

1.2.4 數據分析 應用Microsoft Office Excel 2003、SPSS13.0等軟件進行數據處理與分析（鄧肯法p<0.05）。

2 結果與分析

2.1 轉pPST2a：1-SST基因甘蔗植株的獲得

利用檢測引物F1、F2進行轉pPST2a：1-SST基因植株的PCR檢測，共獲得15個陽性植株。擴增產物經上海生工測序分析，表明擴增所得條帶與目的基因片段完全一致。說明目的基因已經成功整合到甘蔗基因組中，PCR結果如圖1。

2.2 轉pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的干旱及鹽脅迫影響

2.2.1 轉pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的模擬干旱及干旱脅迫 植物對干旱最主要和最早期的反應是缺水，導致葉片萎蔫至干枯，生長受到極大的抑制甚至死亡。

由圖2可知，在模擬干旱實驗中轉基因植株在15% PEG6000的培養基中葉片保持綠色，萎蔫程度較低，生長狀況良好且有不同程度的分蘗，而非轉化植株則已枯萎死亡。在干旱實驗中，轉基因植株地上部生長受到的抑制程度較低，葉片伸長較長，根系生長發達，而非轉化植株的地上部生長相對矮小，根部伸長受到很大的抑制。在模擬干旱及干旱脅迫的條件下，轉基因植株均表現出較強的生存及抗旱能力，轉基因植株的地上部及地下部的生長情況好于未經轉化的植株，尤其是根的發生和伸長都明顯優于對照，說明啟動子pPST2a在根中的特異性啟動表達能力更有利于植株度過干旱逆境。

2.2.2 轉pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的鹽脅迫 鹽脅迫直接造成植株生理干旱，植物對鹽脅迫最主要反應是干旱和光合器官受損，導致葉片萎蔫至干枯，甚至死亡。

由圖3可知，經過1個月的鹽脅迫，轉基因植株出現不同程度的黃化，根系生長也受到不同程度的抑制，但是總體表現出較好的耐鹽性，而對照植株在鹽脅迫中根系生長幾乎趨于停滯，整個植株已經死亡。說明轉pPST2a：1-SST基因甘蔗較對照植株有較強的抗鹽性。

2.3 轉pPST2a：1-SST基因甘蔗與轉rbcs：1-SST基因甘蔗抗旱性的初步比較

2.3.1 干旱脅迫 通過抗旱性比較可以看出，在干旱脅迫下，各株系均出現不同程度的萎蔫，但是相比較之下，未經轉化的植株由于缺水幾乎完全枯黃，趨于死亡，轉rbcs：1-SST基因甘蔗的株系的葉片也出現部分萎蔫和葉黃現象，而轉pPST2a：1-SST基因的甘蔗株系只有少量萎蔫，多數葉片呈現出新鮮綠色（圖4）。轉pPST2a：1-SST基因甘蔗的株系在干旱脅迫后的表現最佳，轉rbcs：1-SST基因甘蔗株系次之，未經轉化的甘蔗株系最差。證明根部特異性啟動子pPST2a在根中的特異性表達更有利于植株度過干旱逆境。

2.3.2 逆境相關生理生化指標結果 從圖5可知，未受干旱脅迫時，各株系間生理生化指標差異不顯著，但經過干旱脅迫后，轉pPST2a：1-SST基因各株系的SOD酶活性顯著高于轉rbcs：1-SST基因各株系，未經轉化的株系抗氧化物酶活性最低；轉基因植株的相對電導率（表示原電導值占總電導值的百分比，其中，樣品材料即葉片與去離子水的混合物，室溫下靜止2 h后測得的電導值為原電導值；煮沸15 min后，溫度降至室溫，在渦旋混合器上震蕩1 min后，測得的電導值為總電導值）均顯著高于未經轉化的植株，而轉pPST2a：1-SST基因植株與轉rbcs：1-SST基因植株間差異不顯著；轉pPST2a：1-SST基因各株系的離體葉片保水率（自由水占總含水量的百分比）顯著高于轉rbcs：1-SST基因的各株系，未經轉化株系的離體葉片保水率最低。

3 討論與結論

本研究將參與果聚糖合成的蔗糖：蔗糖-1-果糖基轉移酶基因即1-SST基因，與根部特異性表達啟動子pPST2a組合，用農桿菌介導法遺傳轉化導入甘蔗中，觀察轉基因甘蔗的抗旱性。結果表明，在干旱脅迫下，未經遺傳轉化的甘蔗植株的膜脂可能發生了過氧化作用，加劇活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生和富集，這些有毒害作用的分子破壞了膜結構和生物大分子，并且通過受損傷的膜滲透細胞內溶物質，造成質膜的通透性增加，進而導致了大量的電解質外滲[3]。相比之下，轉pPST2a：1-SST基因甘蔗植株在一定程度上所受到的傷害較小。果聚糖能維持脂質體在溫度變化和干旱條件下相態的改變，脂類相態的改變可提高膜的通透性，修復脅迫對膜的損害[14]。1-SST基因編碼的低聚合度果聚糖的積累與轉基因甘蔗抗旱性的提高有關，這與SacB基因編碼的高聚合度果聚糖通過促進根的生長來提高植物抗旱性的實驗結果相一致[13-14]。

植物根部在抗旱及耐鹽性上有重要的作用，本研究通過2種不同啟動子驅動下的轉1-SST基因甘蔗的抗旱性比較實驗，證實在干旱條件下，轉pPST2a：1-SST基因各株系與轉rbcs：1-SST基因各株系相比，更能減少水的流失，更有效地提高了抗氧化物酶的活性，從而使轉pPST2a：1-SST基因甘蔗植株獲得更高的抗旱性；根部特異表達啟動子pPST2a驅動下1-SST基因的轉化甘蔗的抗旱性及耐鹽性得到進一步的提高。說明在缺水條件下，根部特異性表達啟動子pPST2a驅動的轉1-SST基因甘蔗在干旱逆境脅迫中更能穩定的順應、度過干旱逆境，同時證實了該轉基因方法在甘蔗新品種培育中具有潛在的應用性。

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責任編輯：古小玲