PAX6在酒精處理幼鼠神經(jīng)細胞損傷的影響

趙娟等

【摘要】目的：探究PAX6在酒精處理幼鼠中對神經(jīng)細胞損傷的影響。方法：妊娠5d小鼠隨機分為2組，在仔鼠出生后7天時建模，實驗組用20%的酒精溶液，按每只2.5克/千克分兩次皮下注射，兩次間隔兩小時；對照組用生理鹽水代替酒精做同樣的處理。24h后，取腦組織切片進行HE和PAX6免疫組化染色。結(jié)果：HE染色結(jié)果說明皮質(zhì)和丘腦下部均有一定量神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡，免疫組化顯示實驗組中PAX6的在皮質(zhì)和丘腦下部的表達均較對照組明顯升高。結(jié)論：酒精對仔鼠神經(jīng)細胞的損傷可能與PAX6轉(zhuǎn)錄因子過量表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】酒精；PAX6；轉(zhuǎn)錄因子；神經(jīng)細胞；凋亡

【中圖分類號】R245 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）01-0269-01

基金項目：湖南省教育廳科技項目（12C0510）

酒精作為常見的致畸原，與人類的生長發(fā)育緊密相關(guān)。能夠使中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變、以及精神行為異常等[1]。目前認為酒精是導致兒童智力障礙的可預防的非遺傳性因素。酒精對神經(jīng)細胞有直接或間接的毒害作用，可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細胞的大量凋亡[2]，尤其是在快速發(fā)育期或突觸形成期，即使接觸一次酒精也能造成小鼠大腦皮質(zhì)和小腦神經(jīng)元的凋亡[3]。

PAX6基因編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，在脊椎動物中不僅對中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長有重要的作用[4]，還對腦的發(fā)育和結(jié)構(gòu)完整性有一定影響[5]。PAX6的作用在正常和異常的細胞增生中均有影響，廣泛覆蓋細胞的增生、移行、黏附和信號傳導等各個途徑[6]。本文就酒精處理仔鼠中PAX6的表達情況作一研究，為臨床上酒精對神經(jīng)細胞損傷的治療和研究提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

（1） 動物與藥品、器材：湖南農(nóng)大動物中心提供的成年昆明小鼠，體重20-30g；56°紅星二鍋頭，由北京紅星股份有限公司提供；PAX6抗體購自英國abcam公司，冰凍切片機是德國slee公司MEV型號；顯微鏡是日本OLYMPUS公司BX51T-32P01型。

（2） 實驗動物的分組：雌、雄鼠合籠，每日8時檢查雌鼠是否有陰道栓確定

受孕日期，定為妊娠開始，妊娠5d小鼠隨機分為2組：對照組和試驗組。幼鼠出生第1天稱為P0（P=days postnatal，P0=the first 24hours afterbirth），在仔鼠P7齡時，按Ikonomidou C的方法建模[7]，試驗組用20%的酒精溶液，每只按2.5克/千克分兩次皮下注射，兩次間隔兩小時；對照組用生理鹽水代替酒精做同樣的處理，24小時后，取材對大腦進行組織檢查。

（3） 取2組幼鼠，2.5%三溴乙醇（16mL/kg）腹腔注射麻醉，用生理鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)心灌流。取出大腦組織，4%甲醛固定過夜，30%蔗糖脫水至組織沉底。PBS（0.1 mol/L，pH7.4）液沖洗干凈后，用包埋膠-30℃包埋，制成切片標本。冰凍切片機切片，厚度為20μm。

（4） HE染色：蘇木素染色，自來水洗，分化，自來水浸泡，伊紅染色，常規(guī)脫水、透明、封片。

（5） 免疫組化：一抗是rabbit anti-PAX6 receptor，切片置于4 ℃含一抗的體積分數(shù)為5%血清和0.3%Triton-100的PBS溶液中反應過夜，次日經(jīng)PBS浸洗后，切片在相應的二抗里孵育2 h，HRP標記鏈霉菌抗生素蛋白三抗1h，DAB顯色，然后在顯微鏡下觀察檢測。

2結(jié)果

2.1 酒精對神經(jīng)細胞的影響

對照組中神經(jīng)細胞形態(tài)規(guī)則并可見突觸，而在實驗組中細胞在組織中成單個散在分布，呈圓形，細胞核聚集成團塊狀深染，胞質(zhì)濃縮紅染，說明在實驗組酒精處理后神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡[8]。（圖1）

3討論

酒精是一種親神經(jīng)物質(zhì)，對人體許多系統(tǒng)器官均有損傷作用，其中神經(jīng)系統(tǒng)是其損傷的重要靶器官之一。研究顯示酒精暴露可導致兒童腦發(fā)育障礙進而引起學習、記憶、智力水平下降和精神行為功能缺陷，即使停止濫用，已造成的損害仍將繼續(xù)。

實驗結(jié)果證明了PAX6轉(zhuǎn)錄因子在幼鼠皮質(zhì)和丘腦下部中的表達，進一步的免疫組化分析顯示，主要在兩個區(qū)域內(nèi)表達上調(diào)。這些實驗初步論證了幼鼠皮下注射酒精后以后，PAX6轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)與神經(jīng)細胞死亡的關(guān)系。對于臨床上酒精致神經(jīng)細胞損傷治療來說，PAX6有望作為一個基因診斷和基因治療的靶點[9]。

綜上所述，在酒精導致神經(jīng)元損傷過程中PAX6的過量表達可能是重要機制之一。現(xiàn)今認為的機制可能有：自由基損傷，視黃醛缺少，基因表達水平改變，細胞膜結(jié)構(gòu)變化和生長因子活性改變五大類。酒精可能通過這些不同的機制協(xié)同起作用，使中樞神經(jīng)發(fā)生一系列生化反應，造成分子、細胞等各水平變化，最終導致了神經(jīng)細胞的損傷。

參考文獻

[1]許雅君，柳鵬，李勇.酒精對小鼠胚胎腦線粒體發(fā)育的影響[J].衛(wèi)生研究，2005，34（1）：61-63.

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[3]Dikranian K，Qin YQ，Labruyere J，et a1.Ethanol-induced neuroapoptosis in the developing rodent cerebellum and related brain stem structures[J].Brain Res Dev Brain Res，2005，155（1）：1.

[4]王家增，孫晉浩，楊琳.神經(jīng)干細胞體外研究的現(xiàn)狀[J].山東醫(yī)學高等專科學校學報，2006，28（5）：391-394.

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[7]Ikonomidou C，Bittigau P，Ishimaru M J.Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome[J].Science，2000，2879（11）：1056-1060.

[8]魏文科.介紹一種觀察凋亡細胞形態(tài)學特征的染色方法——蘇木素-伊紅染色法（HE染色法）[J].生物學通報，2003，38（5）：49-50.

[9]李藝，彭英.胎兒酒精中毒綜合征及其發(fā)病機理的研究進展[J].中國神經(jīng)精神疾病，2008，34（3）：188-190.