秸稈沼氣發酵預處理微生物菌劑的篩選與特征研究

張瑞等3334

摘要

[目的] 研究添加微生物菌劑對秸稈沼氣發酵產氣效果的影響。[方法] 從沼氣發酵液、樹木土壤和堆肥中分離出多種微生物。通過初篩、復篩、拮抗試驗等方法保留其中10種進行菌株配伍，選擇產酶最高的4種微生物組合研制微生物菌劑。[結果] 4種產酶最高的微生物組合中12號纖維素酶活最高，為11.398 U/ml；8號漆酶酶活最高，為0.083 U/ml。6號微生物菌劑與秸稈的投料質量比為1∶50時，產氣量最高。[結論] 該研究制備的復合微生物菌劑，作為秸稈沼氣發酵預處理菌劑具有良好的應用前景。

關鍵詞 秸稈；微生物菌劑；沼氣發酵

中圖分類號 S181.3；X172 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03334-04

Abstract [Objective] The research aimed to study the effect of agents for pretreatment of biogas fermentation by adding microbial agents.

[Method] A variety of microorganisms were isolated from methane fermentation broth， trees and compost in the soil. Ten kinds of them were retained through screening， rescreening and antagonistic experiments. Four kinds of microorganisms with highest enzyme activity were retained for the development of microbial agents.

[Result] The results showed that No.12 and No.8 groups of microorganisms owned the highest cellulase activity and laccase activity of 11.398 U/ml and 0.083 U/ml， respectively. Among all combinations， the gas production of No.6 was highest with No.6 agents and straw feed ratio of 1∶50.

[Conclusion] The compound microbial agents prepared in this study had excellent application prospects as biogas fermentation agents with straws.

Key words Straw； Microbial agents； Biogas fermentation

我國每年可產生農作物秸稈約7億t[1]，其最主要的利用方式為直接燃燒，這樣既造成了資源的浪費，又對生態環境造成了嚴重的破壞。研究表明，以秸稈為原料發酵產氣潛力非常巨大[2-3]，能源回收率可達52.18%[4]。2010年，我國沼氣產量超過了130億m3，生物氣使用者達到了1.5億人[5]。秸稈類物質因含有大量的纖維素、木質素、半纖維素等而不易降解[6]，若將秸稈直接入池發酵，秸稈表面的蠟質層未被破壞而易漂浮結殼，導致產氣不佳。故在秸稈入池之前需對其進行預處理[7-9]。經過發酵劑的腐解， 原料中大分子有機物質充分分解為小分子糖類和酸類物質， 從而促進發酵， 使產氣量增加[10]。

與物理法、化學法相比，微生物預處理具有條件溫和、成本低和不存在環境污染等特點。近年來科研工作者采用紫外、DES、硫酸二乙酯、60Co-射線誘變等單一或復合誘變方法，不斷篩選出高效降解纖維素的菌株[11-14]。同時，降解木質素的研究也有了一定的進展。如劉慶玉等分離篩選出1 株木質素降解菌X3，其35 d對木質素的降解率達43.31%[15]；陳敏等利用紫外誘變選育及高效篩選技術，從活性污泥中選育出高效降解黑液中木質素的優勢混合菌和單一菌等[16]。然而，木質纖維素的完全降解是真菌、細菌及相應微生物群落共同作用的結果[17]。有不少研究嘗試使用復合菌來處理木質纖維素[18-19]，以期達到快速降解的目的。鑒于此，筆者從沼氣發酵液、樹木土壤和堆肥中分離出多種好氧及厭氧微生物，并篩選出其中對木質素降解效果較好的菌種進行配伍，制備成專性的微生物預處理菌劑，以期對秸稈沼氣發酵的效果起到更好的促進作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

微生物來源：實驗室儲備的豬糞加秸稈厭氧沼氣發酵罐的沼液、堆肥、樹木土壤。秸稈：連云港某農田。豬糞：南京浦口區某養豬場。

1.2 培養基

[20]

培養基Ⅰ：K2HPO4，0.225 g；MgSO4，0.090 g；KH2PO4，0.225 g；CaCl2·2H2O，0.030 g；（NH4）2SO4，0.225 g；酵母膏， 0.100 g；NaCl，0.450 g；秸稈粉，20 g；L-半胱氨酸，0.5 g， 蒸餾水，1 000 ml。用于從沼液中分離各種微生物。培養基Ⅱ：牛肉膏蛋白胨培養基，用于分離細菌。培養基Ⅲ：高氏1號培養基，用于分離放線菌。培養基Ⅳ：査氏培養基，用于分離霉菌。培養基Ⅴ：馬鈴薯培養基，用于分離真菌。

1.3 試驗方法

1.3.1

菌種的分離。利用培養基Ⅰ，通過稀釋平板法，從沼氣發酵液中分離出好氧及兼型厭氧兩種條件下的多種微生物，為第一部分微生物。

好氧方法為：用保鮮膜將平板包裹，倒置，放入30 ℃恒溫培養箱中進行培養；兼型厭氧方法為：用保鮮膜將平板包裹，倒置，放在真空干燥器中。然后將真空干燥器抽真空，再充滿N2，最后放入30 ℃恒溫培養箱中進行培養。

利用培養基Ⅱ-Ⅴ，通過稀釋平板法分別從樹木土壤和堆肥中分離出多種微生物，為第二部分微生物。

1.3.2

菌種的初篩。對于第一部分微生物，利用液態培養基Ⅰ，分別進行富集培養，置于30 ℃恒溫培養箱內培養5～7 d。再向其中分別加入相同質量的秸稈，充分混合，微生物在秸稈表面生長，對其進行降解。8～10 d以后，對秸稈中的木質素、纖維素、半纖維素的前后含量變化進行測定。從而篩選出降解效果好的優勢菌種。

對于第二部分微生物，用各自的液態培養基進行富集培養，在30 ℃恒溫培養箱中培養5～7 d。取100 ml菌液于烘干至恒重的濾紙上過濾，烘干。二者差值即為單位體積菌液中含微生物的質量。篩選出其中質量較大的微生物。

1.3.3

菌種的復篩。對“1.3.1”中篩選出來的微生物進行液態培養基Ⅰ發酵培養，5～6 d后，取適量的菌液。將菌液置于離心機中進行離心，2 500 r/min 10 min后，取上清液。

用兩種方法測定菌液的酶活，即纖維素酶活[21]和漆酶酶活[22]。根據酶活大小，選擇優勢菌種。

1.3.4

菌種拮抗試驗。將“1.3.3”中選出的優勢菌種進行兩兩拮抗試驗。根據拮抗試驗中微生物的生長情況，舍棄最不易與其他微生物共生的菌株。

1.3.5

復合微生物菌劑的制備。

1.3.5.1

菌種配伍試驗。對“1.3.4”中篩選出的微生物進行配伍。

將每一組組合的微生物混合，在液態富集培養基Ⅰ上培養，培養3～5 d，測定每一組的纖維素酶活和漆酶酶活。

比較兩種酶活的大小，選擇較高的4組配伍，進行下一步試驗。

1.3.5.2

菌劑的制備。

將篩選出來的4種微生物配伍分別接種到加富培養基中進行發酵培養，獲得高濃度微生物菌液，將菌液過濾，用蒸餾水反復洗滌3次，60 ℃低溫真空干燥，獲得微生物菌劑。

1.3.5.3

菌劑預處理秸稈沼氣發酵。 取4組干粉菌劑0.15 g，分別加入10 ml含100 mg葡萄糖的溶液中進行糖化1 d，過濾，與15 g秸稈混合，37 ℃條件下預處理5～7 d。然后，將秸稈撈出，與豬糞按干質量1∶5，即15 g∶75 g混合，進行沼氣發酵，中溫37 ℃發酵30 d，并記錄每日產氣量，與不進行預處理的秸稈進行對比，選出產氣量最高的一組菌種。試驗裝置如圖1所示。

1.3.5.4

菌劑用量最優化試驗。對篩選出的優勢菌劑，按不同比例與秸稈混合，進行預處理，放入37 ℃恒溫培養箱中，厭氧發酵產沼氣。通過沼氣量的大小，最終確定菌劑與秸稈的最佳投料比。

干粉菌劑與秸稈的質量比分別取1號1∶1 000、2號1∶500、3號1∶100、4號1∶50和5號1∶20，其中秸稈統一添加15 g。

3 結論

該研究系統地從沼氣發酵液、樹木土壤和堆肥中分離出多種微生物。通過初篩從中選出了16種優勢菌種，再通過測定纖維素酶活與漆酶酶活的大小，從這16種微生物中選取了12種優勢菌株，進行拮抗試驗和菌株配伍，確定了4組產酶較高的微生物組合，并制成了對應的菌劑。最后，利用這4種菌劑對秸稈進行預處理，并投入沼氣罐中，在37 ℃條件下進行厭氧發酵，根據30 d產氣量，確定了6號菌劑為最優菌劑。最后，改變6號菌劑與秸稈的投料比，結果表明二者質量比為1∶50時，產氣量最高。試驗制備的復合微生物菌劑，作為秸稈沼氣發酵預處理菌劑具有良好的應用前景。

參考文獻

[1]

卞有生.生態農業中廢棄物的處理與再生利用[M].北京：化學工業出版社，2001.

[2] 王效華，高樹銘.中國農村能源可持續發展現狀、挑戰與對策略[J].中國沼氣，2003，21（4）：41-42.

[3] 鄧可組.中國農村能源綜合建設理論與實踐[M].北京：中國環境科學出版社，2000.

[4] 胡曉明，張建萍，張無敵，等.香根草中溫發酵產沼氣的實驗研究[J].科技信息，2008（27）：8-9.

[5] 高星愛，李楠，黃梟，等.利用微生物處理技術發酵產沼氣的研究進展[J].安徽農業科學，2011，39（31）：19320，19426.

[6] 胡曉明，張無敵，尹芳，等.微生物預處理稻草秸稈產沼氣試驗研究[J].安徽農業科學，2010，38（23）：12797-12799.

[7] WOOD T.Metal Bilchemistry and Geneties of Cellulose Degredation[M].FEMssymp Academic，1988：31.

[8] 黃如一，何萬寧，唐和建，等.秸稈預處理產沼氣對比試驗[J].中國沼氣，2008，26（4）：24-26.

[9] 石衛國.生物復合菌劑處理秸稈產沼氣研究[J].農業工程學報，2006，22（1）：93-95.

[10] 來航線，楊興華，焦延雄，等.菌劑預處理原料對沼氣發酵效果的影響[J].西北農業學報，2011，20（6）：199-202.

[11] 王春麗，武改紅，陳暢，等.黑曲霉原生質體誘變選育β-葡萄糖苷酶高產菌株[J].生物工程學報，2009，25（12）：1921-1926.

[12] 陳亮，遲乃玉，張慶芳.低溫纖維素酶菌株CNY086 選育及發酵培養基優化（Ⅰ）[J].微生物學通報，2009，36（10）：1547-1552.

[13] 許志，曾柏全，宋睿.高產纖維素酶菌株篩選及誘變選育[J].中國農學通報，2011，27（24）：108-111.

[14] 周新萍，徐爾尼，汪金萍.高產纖維素酶生二素鏈霉菌的鑒定與選育研究[J].中國釀造，2007（16）：20-24.

[15] 劉慶玉，陳志力，張敏.木質素降解菌的篩選[J].太陽能學報，2010，31（2）：269-272.

[16] 陳敏，郭鵬，宋曉崗，等.選育高效降解木質素優勢混合菌的研究[J].中國造紙，1998（3）：40-45.

[17] KARMAKAR S，GREENE H L.Oxidative destruction of chlorofluorocar- bons by zeolite catalysts[J].J Catal，1992，138：364.

[18]

GUTIERREZ-CORREA M，PORTAL L，MORENO P，et al.Mixed culture solid substrate fermentation of Trichoderma reesei with Aspergillus niger on sugar cane bagasse[J].Bioresour Technol，1999，68（2）：173-178.

[19] AWAFO V A，CHAHAL D S，SIMPSON B K.Evaluation of combination treatments of sodium hydroxide and steam explosion for the production of cellulose-systems by two T.reesei mutants under solid-state fermentation conditions[J].Bioresour Technol，2000，73（2）：235-245.

[20] 喬維川，李忠正.嗜黑液菌厭氧降解過程中木質素結構的變化[J].南京林業大學學報：自然科學版，2007，31（5）：34-38.

[21] 趙玉萍，楊娟.四種纖維素酶酶活測定方法的比較[J].食品研究與開發，2006，27（3）：116-118.

[22] BOURBONNAIS R，PAICE M G.Demethylation and delignification of kraft pulp by Trametes versicolor in the presence of 22′azinobis（3ethylbenzthiazoline6sulphonate）[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1992，36（6）：823-827.