環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的引物設(shè)計(jì)與篩選研究

王德國　王永真　王愛萍

摘要 [目的]研究引物設(shè)計(jì)與非特異擴(kuò)增之間的關(guān)系。[方法]以單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的特異性基因hlyA與沙門氏菌（Salmonella）的特異基因invA為例設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。[結(jié)果]就環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的任何2條引物而言，如果2條引物3端的3～4堿基在同一條引物上都有2個(gè)互補(bǔ)序列，在常用的LAMP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件下，必然有非特異性擴(kuò)增，LAMP引物設(shè)計(jì)與篩選應(yīng)避免這種情況出現(xiàn)。[結(jié)論]按照該試驗(yàn)的原則設(shè)計(jì)引物，可降低非特異性擴(kuò)增。

關(guān)鍵詞 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）；引物設(shè)計(jì)；非特異性擴(kuò)增

中圖分類號 S188；Q81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03166-03

Study on Primer Design and Screening of Loopmediated Isothermal Amplification

WANG Deguo et al

（Henan Postdoctoral Research Base， Food and Bioengineering College， Xuchang University， Xuchang， Henan 461000）

Abstract [Objective] To study relationship between primer design and nonspecific amplification. [Method] With specific gene hlyA of Listeria monocytogenes and specific gene invA of Salmonella as examples， loopmediated isothermal amplification （LAMP） was conducted. [Result] As far as any two primers of LAMP primers were concerned， there should be nonspecific amplification if 3-4 bases at 3 end of both primers had two complementary sequences on a same primer， LAMP primers should be designed and screened to avoid such situation. [Conclusion] LAMP reaction did not have nonspecific amplification with primers designed according to above principle.

Key words Loopmediated isothermal amplification （LAMP）； Primer design； Nonspecific amplification

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.31172331和No.U1204330）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目（No.2012GGJS-172）；許昌學(xué)院杰出青年骨干人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目。

作者簡介 王德國（1975- ），男，山東菏澤人，副教授，博士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

收稿日期 20140301

日本學(xué)者Notomi等2000年研究報(bào)道了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loopmediated Isothermal Amplification，LAMP）[1]，該技術(shù)2對引物識(shí)別靶序列的6個(gè)片段，可靈敏、快速、特異性擴(kuò)增靶序列。而且，Nagamine等在反應(yīng)體系中加入環(huán)引物進(jìn)一步縮短了反應(yīng)時(shí)間[2]。因此，該擴(kuò)增方法在特異性、靈敏度與檢測速度方面優(yōu)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）[3-4]、核酸序列依賴性擴(kuò)增法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA）[5-6]、鏈置換擴(kuò)增（Strand Displacement Amplification，SDA）[7]、滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification，RCA）[8]和解鏈酶擴(kuò)增技術(shù)（Helicase Dependent Amplification，HDA）[9]。然而，該技術(shù)經(jīng)過大約15年的研究與開發(fā)還沒有被實(shí)際應(yīng)用，由于非特異擴(kuò)增導(dǎo)致該技術(shù)的假陽性率高，有關(guān)內(nèi)容將在別處報(bào)道。試驗(yàn)通過引物設(shè)計(jì)與篩選探索解決非特異擴(kuò)增的方案以L.monocytogenes的特異性基因hlyA與Salmonella的特異基因invA為例開展研究，旨在研究引物設(shè)計(jì)與非特異性擴(kuò)增之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 引物 針對L.monocytogenes的特異性基因hlyA采用PrimerExplorer 4軟件設(shè)計(jì)了一套LAMP引物[10]，在這套引物的研究基礎(chǔ)上，針對Salmonella的特異基因invA采用PrimerExplorer 4與Oligo7軟件設(shè)計(jì)篩選了第2套LAMP引物[11]，如表1所示，這2套引物均由生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 DNA模板 為了區(qū)分氣溶膠污染與非特異擴(kuò)增以及更好地研究引物設(shè)計(jì)與非特異擴(kuò)增之間的關(guān)系，試驗(yàn)不提取L.monocytogenes的DNA模板，也不使用該菌的DNA模板；于37 ℃過夜培養(yǎng)沙門氏菌S.enterica ATCC 13076，使用UNIQ10柱式DNA提取試劑盒提取基因組（生物工程（上海）有限公司）。

1.3 L.monocytogenes引物的等溫?cái)U(kuò)增 在25 μl的反應(yīng)體系中，含有1.25 mmol/L的dNTPs、1 mol/L的甜菜堿（Sigma）、20 mmol/L TrisHCl（pH 8.8）、10 mmol/L的KCl、10 mmol/L的（NH4）2SO4、6 mmol/L的MgSO4、0.1%的Triton X100、1×的EvaGreen、1×的Rox和8 U的Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase（large fragment，New England Biolabs）[10]，不同反應(yīng)管中加入不同的引物組合（HLYFIP+HLYBIP+HLYF3+HLYB3+HLYLF+HLYLB；HLYFIP+HLYLF；HLYFIP+HLYB3；HLYFIP+HLYLB；HLYFIP+HLYF3；HLYBIP+HLYF3；HLYBIP+HLYLB；HLYF3+HLYB3），引物HLYFIP、HLYBIP、HLYF3、HLYB3、HLYLF和HLYLB的濃度分別為0.8、0.8、0.4、0.4、0.1和0.1 mmol/L，為了避免氣溶膠交叉污染而確定非特異擴(kuò)增，所有反應(yīng)管中均不加DNA模板。在StepOnePlus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)65 ℃擴(kuò)增95 min。

1.4 Salmonella引物的LAMP反應(yīng) 反應(yīng)體系如上，陽性對照與陰性對照中加入Salmonella的所有LAMP引物，陽性對照中加入10 ng的DNA模板。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.monocytogenes特異基因hlyA的LAMP引物分析 試驗(yàn)對7種不同的引物組合（HLYFIP+HLYLF；HLYFIP+HLYB3；HLYFIP+ HLYLB；HLYFIP+HLYF3；HLYBIP+ HLYF3；HLYBIP+HLYLB；HLYF3+HLYB3）進(jìn)行分析，如圖1所示，其中3對引物組合（HLYFIP+HLYLF；HLYFIP+HLYB3；HLYFIP+ HLYLB）存在相同的情況，2條引物3端的3～4個(gè)堿基在同一條引物上都有2個(gè)互補(bǔ)序列；至于引物組合HLYFIP與HLYF3，引物HLYF3的3端3個(gè)堿基在引物HLYFIP有1個(gè)互補(bǔ)序列，引物HLYFIP的3端3個(gè)堿基在引物HLYFIP有2個(gè)互補(bǔ)序列；其他3對引物組合（HLYBIP+HLYF3，HLYBIP+ HLYLB，HLYF3+HLYB3），在同一個(gè)引物上沒有或互補(bǔ)序列較少。

2.2 L.monocytogenes LAMP引物的等溫?cái)U(kuò)增 所有反應(yīng)管中均未加L.monocytogenes的DNA模板，添加了所有引物的反應(yīng)管與添加了其他3種引物組合（HLYFIP+HLYLF；HLYFIP+HLYB3；HLYFIP+ HLYLB）有非特異性擴(kuò)增，溶解曲線各不相同；至于引物組合HLYFIP與HLYF3，其中2個(gè)陰性對照有非特異擴(kuò)增，另2個(gè)陰性對照無非特異擴(kuò)增；其他3對引物組合（HLYBIP+HLYF3，HLYBIP+ HLYLB，HLYF3+HLYB3）無非特異性擴(kuò)增。

綜合L.monocytogenes的引物分析與等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果可知，就環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的任何2條引物而言，如果2條引物3端的3～4堿基在同一條引物上都有2個(gè)互補(bǔ)序列，在常用的LAMP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件下，必然有非特異性擴(kuò)增，LAMP引物設(shè)計(jì)與篩選應(yīng)避免這種情況出現(xiàn)。使用PrimerExplorer 4軟件并按照該結(jié)論設(shè)計(jì)篩選hlyA的LAMP引物，未能篩選出可用的引物；然而，當(dāng)Salmonella的invA基因作為靶序列時(shí)，篩選出了一套LAMP引物，不存在上述情況，如表1和圖2所示。

圖1 L.monocytogenes特異基因hlyA的LAMP引物分析

圖2 Salmonella特異基因invA的LAMP引物分析

2.3 Salmonella引物的LAMP反應(yīng) 使用上述引物擴(kuò)增檢測Salmonella的特異基因invA，2個(gè)陰性對照不存在非特異性擴(kuò)增，當(dāng)DNA模板為10 ng/reaction，可以在35 min內(nèi)檢出特異基因invA，2個(gè)陽性對照的熔解曲線Tm值為81.17 ℃。

3 結(jié)論與討論

目前該領(lǐng)域的科研工作者普遍認(rèn)為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)靈敏度高，容易產(chǎn)生氣溶膠污染，交叉污染是導(dǎo)致假陽性率高的主要原因，在實(shí)現(xiàn)不開蓋檢測方面進(jìn)行了大量研究與嘗試，如濁度法檢測[12]、實(shí)時(shí)濁度法檢測[13]、熒光染料檢測[14-15]、免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垯z測[16]、使用指示劑羥基萘酚藍(lán)檢測[17-18]以及日本榮研公司的鈣黃綠素檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測手段近乎非常完美，但不開蓋檢測并沒有把環(huán)介導(dǎo)等溫

注：PC為陽性對照，10 ng DNA Template/reaction；NC為陰性對照。

圖3 Salmonella特異基因invA LAMP擴(kuò)增檢測結(jié)果

擴(kuò)增推向?qū)嶋H應(yīng)用。試驗(yàn)結(jié)果表明，導(dǎo)致假陽性的主要原因是引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，通過調(diào)整反應(yīng)調(diào)節(jié)可明顯降低非特異性擴(kuò)增，該研究成果已投其他期刊報(bào)道。為了增強(qiáng)LAMP的特異性擴(kuò)增，試驗(yàn)重點(diǎn)研究了引物設(shè)計(jì)與非特

異性擴(kuò)增之間的關(guān)系，在引物設(shè)計(jì)與篩選方面探索降低LAMP非特異性擴(kuò)增的方法。

試驗(yàn)表明，就環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的任何2條引物而言，如果2條引物3端的3～4堿基在同一條引物上都有2個(gè)互補(bǔ)序列，在常用的LAMP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件下，必然有非特異性擴(kuò)增，LAMP引物設(shè)計(jì)與篩選應(yīng)避免這種情況出現(xiàn)，但這種非特異性擴(kuò)增的機(jī)理需要進(jìn)一步研究。以Salmonella的特異基因invA為靶序列，設(shè)計(jì)篩選出一套LAMP引物不存在這種情況，并且陰性對照不存在非特異性擴(kuò)增。

總之，LAMP檢測的假陽性主要是引物之間的非特異性擴(kuò)增引起的。因此，引物設(shè)計(jì)與篩選至關(guān)重要[19]，試驗(yàn)提出了一種引物設(shè)計(jì)與篩選的方法，有助于LAMP技術(shù)的快速推廣應(yīng)用。

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