基于生物反應器探究制藥廢水中活的但非可培養狀態細菌的組成

金夷 周小玲 翟竟余等

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摘要 [目的]探究制藥廢水中活的但非可培養（viable but nonculturable，VBNC）狀態細菌的組成與系統關系。[方法]利用土質濾材構建生物反應器，基于復蘇促進因子（resuscitation promoting factor，Rpf） 對VBNC細菌的復蘇刺激生長作用，采用MPN （most probable number） 法，稀釋平板法分離其中復蘇可培養化的VBNC菌株并解析其16S rRNA基因系統關系。[結果]在MPN培養系中，Rpf對部分細菌有生長刺激作用。制藥廢水中存在對Rpf敏感、復蘇可培養化的VBNC優勢菌群；制藥廢水中對Rpf敏感的VBNC優勢細菌主要有革蘭氏陽性放線菌Microbacterium、Gordonia和Leucobacter屬近緣菌，革蘭氏陰性菌Candidimonas、Xanthobacter和Aminobacter屬近緣菌，其中菌株ZYM1、ZYM3、ZYZR4和ZYXR1可能屬于新種。[結論]研究結果揭示了制藥廢水中存在VBNC狀態細菌，為研究其形成機理、復蘇活性化機制以及制藥廢水的深度處理等提供重要的思路與方法。

關鍵詞 制藥廢水；生物反應器；VBNC菌；Rpf；16S rRNA基因序列系統關系

中圖分類號 S181.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-3156-04

Abstract [Objective] To investigate the composition and phylogenetic relationship of viable but nonculturable bacteria in pharmaceutical wastewater. [Method] Applied soil filter to build the bioreactor， then used resuscitation promoting factor （Rpf） which promoted the resuscitation and growth of VBNC bacteria， combined with most probable number （MPN） method and dilution

plating to isolate the VBNC bacteria and analyzed 16S rRNA gene phylogenetic relationship. [Result] In MPN culture system， Rpf could promote the resuscitation and growth of some bacteria. There were VBNC advantage floras that sensitive to Rpf in pharmaceutical wastewater. The major culturable VBNC bacteria in pharmaceutical wastewater belonged to the high GC gram positive actinomycetes including genera Microbacterium， Gordonia and Leucobacter， and negative bacteria including genera Candidimonas， Xanthobacter， Aminobacter. There were 4 strains ZYM1， ZYM3， ZYZR4 and ZYXR1 could be potential novel species. [Conclusion] This research revealed there were VBNC bacteria in pharmaceutical wastewater. These results can provide important ideas and methods for further study on VBNC bacteria of the pharmaceutical wastewater， especially the formation mechanism and recovery mechanism of VBNC bacteria and the advanced degradation process improvement of pharmaceutical wastewater.

Key words Pharmaceutical wastewater； Bioreactor； VBNC bacteria； Rpf； 16S rRNA phylogenetic relationship

近幾十年來，隨著人類對藥品需求量的快速增長，制藥行業的迅猛發展導致了大量混合制藥廢水的排放。制藥廢水中含有高濃度的懸浮物、鹽、難熔化合物、毒性物質、有機和無機物等，且化學需氧量高，化學法與物理法都難處深度處理制藥廢水[1]，所以高效微生物處理技術已成為研究熱點。利用傳統的微生物培養技術從環境中能分離培養的微生物只占總數的0.01%～10.00%[2]，其他為未培養或活的但非可培養（viable but nonculturable，VBNC）狀態細菌，表明環境中絕大部分微生物尚處于未知狀態。

自從1982年Xu等首次在環境中發現生存但不可培養的霍亂弧菌和大腸桿菌后，至今國內外已有大量文獻報道了VBNC菌的相關內容[3]。細菌由于多種因素導致進入VBNC狀態，且仍具有生物活性但用常規培養法無法檢出，在一定條件下可以復蘇并保持原有功能[4]。1998年Mukamolova等報道了藤黃微球菌（Micrococcus luteus）分泌的一種蛋白質能使該菌以及近緣的分枝桿菌（Mycobacterium）屬的一些處于VBNC狀態的細胞復蘇成為可培養化，這種蛋白質被命名為復蘇促進因子Rpf （resuscitation promoting factor）[5]。已有研究表明，Rpf能復蘇刺激大量革蘭氏陽性菌的生長，包括Mycobacterium、Rhodococcus、Arthrobacter、Leifsonia、Bacillus、Nocardia、Kitasatospora、Streptomyces和Paenibacillus屬的細菌[2-6]。丁林賢等研究表明，Rpf對難培養微好氧貧營養革蘭氏陰性菌Curvibacter fontanus具有良好的促進生長的功能[7]。目前，對于Rpf及VBNC菌的研究主要集中在醫學、流行病學、病原菌分子遺傳學等，其他領域尚少見有報道。2013年蘇等綜述了丁等人在近10年對于VBNC細菌以及在環境治理與修復中所起潛在功能的研究，揭示了Rpf對挖掘環境微生物資源的特殊利用價值[8-9]。筆者從微生物學角度深入研究污水處理系統中VBNC菌體的形成機理，以期為挖掘Rpf及其VBNC微生物資源的可利用性等提供重要的研究思路與理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。制藥廢水，采集于浙江省某制藥公司經前處理的廢水，經生物反應器（串聯多塔式）連續流運行30、61、183和361 d，分別從生物反應器最初出水段三點取樣共取3 g（折算為干重）至滅菌的100 ml錐形瓶中，加入27 ml滅菌蒸餾水攪拌20 min均勻制成懸液待用。

1.1.2 試驗菌種。藤黃微球菌Micrococcus luteus IAM 14879（=NCIMB 13267），由東京大學分子細胞生物學研究所國際菌種保藏中心提供。依據研究介紹的方法制備M.luteus的DNA，確定rpf 基因并在大腸桿菌中表達。rpf基因陽性菌的培養液離心經0.22 μm膜過濾，作為含Rpf的試驗處理組添加材料[6]。

1.1.3 主要儀器。PCR反應擴增儀（TP600），購自日本Takara公司；凝膠成像系統（GelDocIt）

，購自美國UVP公司；酶標儀（1510），購自美國Thermo公司。

1.1.4 主要試劑。UNIQ10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒，16S rRNA基因PCR擴增所用酶、引物和試劑，均購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備。MPN培養系液體培養基為反硝化細菌培養基，其組成為（g/L）：KNO3 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 0.5 g，酒石酸鉀鈉 20.0 g，pH 7.2，121 ℃，15 min高壓滅菌。MPN培養系分離純化用PYM培養基組成（g/L）：蛋白胨 5.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，酵母膏3.0 g，瓊脂 20.0 g，pH 7.0～7.2，121 ℃，15 min高壓滅菌。

1.2.2 MPN法和MPN培養系。利用MPN法[10]和MPN培養系計數樣品可培養細菌總數。以2.5～5.0 ml透明玻璃瓶作為培養容器，添加濃度10%含Rpf制備液至液體培養基中作為處理組，以添加等量不含Rpf制備液作為對照組，將以濃度10%的樣品懸液，以10倍濃度梯度稀釋到10-6，每組重復3次，30 ℃靜置培養。根據培養時間測定處理組與對照組吸光值的變化（OD660），并以OD660值以及肉眼判斷，記錄處理組與對照組培養液的渾濁情況，渾濁為陽性，不渾濁為陰性。利用MPN表查出MPN值對應的處理組與對照組中的細菌總數。

1.2.3 Rpf閾值與VBNC狀態菌的判斷。以處理組與對照組MPN值分別對應的細菌總數之比作為Rpf閾值VR。當VR>5時（95%置信度），處理組的最前方某稀釋段培養液渾濁（陽性），而對照組與之相同稀釋段為不渾濁 （陰性）時，處理組渾濁培養液經稀釋平板分離，純化所得的菌為單位樣品中總數處于優勢的VBNC狀態菌。當5>VR≥1時，處理組與對照組最前端渾濁的培養液分別進行稀釋平板分離，判斷對照組與處理組菌落形態特征的差異，認為處理組中特有的特征性菌落為Rpf敏感的VBNC菌。

1.2.4 菌株分離純化與保存。經3～10 d靜置培養并視MPN值趨于穩定時，將處理組與對照組中最先端呈渾濁的培養液稀釋，利用平板分離法篩選、純化獲得相應的可培養化細菌。將純化的細菌擴大培養用于細菌鑒定，以及添加10%的甘油做成冷凍甘油管在-80 ℃保存。

1.2.5 分離菌株16S rRNA 基因序列與系統發育樹的構建。可培養化VBNC菌株的DNA提取按照生工UNIQ10 柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進行；PCR擴增采用細菌16S rRNA基因通用引物7f （5′CAGAGTTTGATCCTGGCT3′） 和1540r （5′AGGAGGTGATCC AGCCGCA3′）。PCR 反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據結果切割所需DNA目的條帶，用SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒回收，PCR純化產物送上海生工生物工程有限公司測序。測序所得菌株16S rRNA基因序列結果在DDBJ登錄取得菌株登錄號碼，在國際基因庫NCBI和EzTaxon server中進行序列同源性檢索，挑選同源性高的典型菌株的16S rRNA基因序列為參比菌種，利用MEGA 5，按照NeighborJoining法聚類，構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 MPN培養系中MPN值與樣品細菌總數 從制藥廢水連續流生物反應器中取樣4次，MPN培養系中處理組與對照組的MPN值與每克樣品中的細菌總數見表1，通過VBNC的復活率證實制藥廢水中存在利用一般培養基不能檢出，但添加Rpf后對其敏感能復蘇生長成為可培養化的VBNC狀態細菌。

2.2 Rpf閾值及其培養液OD660值的變化 反應器運行30、61、183和361 d所取樣構建的MPN培養體系的Rpf閾值VR分別為16.0，55.8，2.2和1.9，表明制藥廢水生物反應器中，取樣點單位樣品中存在對Rpf敏感的VBNC優勢菌群。圖1表明，培養系中各稀釋段培養液的OD660值，處理組均大于對照組，表明Rpf對培養系中的細菌有生長刺激作用。

2.3 分離菌株的16S rRNA基因序列同源性與系統樹構建 分離純化菌種經測序后，利用國際基因庫NCBI和EzTaxon server進行序列同源性檢索，各分離菌株的檢索結果見表2。處理組中分離到的菌株類型更為豐富，其中Candidimonas、Microbacterium、Gordonia、Aminobacter、Xanthobacter和Leucobacter屬的近緣菌ZYM1、ZYM3、ZYZR2、ZYZR4、ZYYR1、ZYYR2、ZYYR3和ZYXR1在對照組同等數量級培養液中未發現，因而這些細菌可視為經Rpf復蘇生長促進作用成為可培養化的VBNC細菌。

4個階段所分離的17株細菌屬于Proteobacteria門和Actinobacteria門的兩大系統發育類群，包含了高GC的革蘭氏陽性菌的放線菌和革蘭氏陰性菌，共7個科10個屬，挑選同源性高的典型菌株的16S rRNA基因序列為參比菌種，構建的系統發育樹見圖2。

2.4 新種水平菌株的16S rRNA基因系統關系解析 細菌多相分類學鑒定程序中，16S rRNA基因序列相似性在97% （或98%） 以下一般認為有可能是新種。17株分離菌株中發現菌株ZYM1、ZYM3、ZYZR4、ZYYR1、ZYYNR1和ZYXR1與已知近緣菌的同源性較低，可能有存在較大的遺傳差異。特別是ZYM1、ZYM3、ZYZR4和ZYXR1這4株細菌構建系統樹分析后發現極可能代表新的分類單元。菌株ZYM1的最近近緣標準菌是Candidimonas nitroreducens SC089T （FN556191），序列相似性為 97.8%，菌株ZYM3的最近標準菌也是Candidimonas nitroreducens SC089T （FN556191），序列相似性為 97.4%，但從系統樹（圖2）中發現菌株ZYM1，ZYM3與Pusillimonas terrae AS85T （AB727962）離得最近，且這3株菌單獨構成了一個進化分支，表明菌株ZYM1和ZYM3是新種的概率很高。菌株ZYZR4的最近標準菌是Gordonia otitidis IFM 10032T （AB122026），序列相似性為96.6%，且在系統樹單獨形成進化分支，差異性顯著達新種水平。菌株ZYXR1的最近標準菌是Leucobacter aridicollis CIP 108388T （AJ781047），序列相似性為 97.3%，但從系統發育樹中發現菌株ZYXR1單獨形成進化分支，有可能是Leucobacter屬下的一個新種。對于分離到的這4株可培養化VBNC菌株我們將從多相分類學角度綜合它們的形態特征、生理生化、化學分類和相關參比菌株的DNDDNA同源性以及其他關聯基因等進化關系分析進行進一步的探討。

3 結論與討論

研究報道了在土壤與城市污水處理系統中發現基于Rpf復蘇可培養化近緣的放線菌，具有較強的硝化反硝化、生物除臭功能以及利用Rpf分離到的VBNC菌具有較強的生物絮凝作用[11-12]。蘇等報導了從研究電器和電子廢物的多氯聯苯PCBs降解過程中發現活化的VBNC優勢菌能使PCBs達到近乎100%的降解效果，揭示了Rpf與VBNC資源菌種的實際應用價值[9]。試驗對可培養化VBNC優勢菌種ZYM1、ZYM3、ZYZR2、ZYZR4、ZYYR1、ZYYR2、ZYYR3和ZYXR1的已知近緣菌種的功能進行了資料檢索分析，推測其可能具有的潛在環境功能。除了菌株ZYM1和ZYM3的近緣菌在國內外尚未見有相關環境功能的報道外，菌株ZYZR2、ZYZR4、ZYYR1、ZYYR2、ZYYR3和ZYXR1的近緣菌種對于制藥廢水中存在的木質素、酚類化合物、纖維素、鹵代甲烷、菲、芘、萘、二苯并噻吩、甲基氯、乙烯等都有較強的降解功能，并且對于一些難降解農藥甲胺磷及其他一些環境污染物都表現出了可觀的降解作用[12-14]，對此試驗將在以后的VBNC菌種的形成機理、潛在機能等探索試驗中予以深入研究。基于生物反應器利用Rpf從制藥廢水中分離出VBNC菌株為深入研究與重新認識環境生態中微生物復合群集組成，形成機理，復蘇活性化機制，直接獲得微生物菌種資源以及類似難降解制藥廢水深度降解工程工藝的改進等研究提供重要的思路與方法。

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