¹²⁵I體外照射聯合C225誘導MNK—45細胞凋亡及對Bcl—2和Bax表達的影響

李遜 李巍偉 陳明媚等

摘要：目的 探討125I粒子連續體外照射聯合表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑（C225）對人胃癌細胞（MNK-45）的促凋亡作用及對凋亡相關基因Bcl-2和Bax表達的影響，初步了解二者聯合治療胃癌的相關機制。方法 體外培養人胃癌細胞。實驗共分對照組、單藥組、單照組、聯合組。單藥組與聯合組細胞預先經2000μg/ml C225處理。選取放射活度14.49MBq的125I粒子建立體外照射裝置，對單照組和聯合組細胞進行持續照射，對照組與單藥組細胞則置于相同裝置中但未接受125I粒子照射。72h后收集各組細胞，用細胞計數法觀察分析細胞生長情況。流式細胞術檢測細胞凋亡率。RT-PCR檢測細胞Bcl-2和BaxmRNA的表達。 結果 各實驗組細胞增殖均較對照組明顯受抑，倍增時間延長，差異均有顯著性（P<0.05）。各實驗組細胞凋亡率較對照組明顯增加，差異均有顯著性（P<0.05），且聯合組細胞凋亡率較單照組與單藥組均明顯增加，差異有顯著性（P<0.05）。RT-PCR檢測顯示各實驗組較對照組均有不同程度的Bax表達增加、Bcl-2表達減弱以及Bax/Bcl-2比值增加，差異有顯著性（P<0.05），且分別與單藥組和單照組比較，聯合組細胞上述表現最為明顯（P<0.05）。結論 125I粒子體外照射聯合C225可顯著強化對人胃癌細胞MNK-45的凋亡誘導效應；其機制可能與二者協同下調Bcl-2，上調Bax表達，進一步提高Bax/Bcl-2比值有關。

關鍵詞：125I粒子；表皮生長因子受體抑制劑；人胃癌細胞；凋亡；Bcl-2；Bax

125I粒子永久組織間植入作為一種微創放射治療手段，目前已被廣泛運用于不同分期及病理類型胃癌的臨床治療并獲得良好效果[1-3]。表皮生長因子受體（EGFR）因其明確的惡性生物學特性而成為腫瘤治療的重要靶點。EGFR抑制劑西妥昔單抗（C225）為近年來研發的一種針對EGFR的高效分子靶向藥物，現已被用于多種腫瘤的臨床輔助治療。本實驗通過125I粒子外照射聯合C225作用于人胃癌細胞MNK-45，觀察其對細胞的凋亡誘導效應，并對Bcl-2及Bax表達情況進行量化分析，旨在初步探討二者聯合的抗胃癌機制，為臨床應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1試劑與儀器 注射用C225（100mg/50ml/瓶））由德國Boehringer公司生產；人胃癌細胞株MNK-45（EGFR高表達系）購自南京凱基生物科技發展有限公司；125I粒子（放射性活度14.49MBq）購自上海欣科醫藥公司；高糖型（DMEM）培養液為美國Hyclone公司產品；青鏈雙抗為Hyclone公司產品；胎牛血清購為烏拉圭GIBCO公司產品；β肌動蛋白（β-actin）、 （Bcl-2）和（Bax）基因PCR引物均由由上海生物工程技術服務有限公司合成，基因片段擴增的引物序列見表1。（ABI）實時定量熒光PCR儀購自美國 ABI公司。流式細胞儀購自美國BECKMAN COULTER公司，顯微拍攝系統為日本NIKON公司產品。

1.2方法

1.2.1細胞培養及標本制作 含10%胎牛血清的DMEM培養液培養MNK-45細胞，將其置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養箱中，2～3d傳代1次。取對數生長期細胞，以3×106/ml的濃度接種于直徑為35mm的培養皿中，共接種16個皿，每皿約有3ml細胞懸液。24h后（待細胞貼壁、穩定）用于實驗。

1.2.2建立外放射模型 根據曼徹斯特系統布源原理，將放射活度為14.49MBq型125I粒子9粒，依據Meredith設計的近距離照射治療體外細胞試驗布源系統制作模型（圖1）。根據美國醫用物理學家協會（AAPM） 發布的放射劑量計算公式得出該125I粒子外放射模型72h放射總劑量約為113cGy。

1.2.3實驗分組 實驗共分四組，對照組、單照組、單藥組、聯合組。每組4個培養皿，單藥組與聯合組預先加入2000μg/ml C225約0.35ml，使培養皿內C225濃度達到約200μg/ml（參考C225穩態血藥濃度均值）。對照組和單照組則加入等量培養基。將四組細胞置入照射模型，其中單照組與聯合組接受125I粒子照射，對照組與單藥組則不接受照射，72h后收集細胞。

1.2.4細胞增殖檢測 72h后，取對照組和3個實驗組分別進行細胞計數。根據細胞計數結果，以培養皿單位細胞數（細胞數/ml）為縱坐標，觀察時間為橫坐標繪制生長曲線。根據Patterson公式計算細胞群體倍增時間（doubling time，TD）：TD=T×log2/（logNt-logN0），其中N0為初始細胞數，Nt為終末細胞數，T為Nt～N0的時間。然后進行對比和統計學分析。

1.2.5常規流式細胞法（FCM）碘化丙啶（PI）染色檢測細胞凋亡 取培養皿細胞，棄培養液，以磷酸鹽緩沖液洗滌，0.25%胰酶消化，PBS緩沖液吹打收集制成細胞懸液，調整細胞濃度至1×106/ml，2000r/min離心、重懸，去上清液；沉淀物PBS洗滌2次，加入DNA-PREP試劑盒中的核糖核酸酶200μl，避光保存15min，然后加入PI 1000μl，避光保存15min，上機檢測。

1.2.6半定量RT-PCR檢測Bcl-2和Bax mRNA的表達 內參β-actin上游引物為5'-AAGGCCAACCGCGAGAA-3'，下游引物為5'- CCTCGTAGATGGGCACA-3'，擴增片段長度為176bp；Bax上游引物為5'-GGATGATTGCCGCCGT-3'，下游引物為5'-CCCAGTTGAAGTTGCCGT-3'，擴為增片段長度92bp：Bcl-2上游引物為5'-ACAGAGAACCATCCCTATT-3'，下游引物為5'-GAGAGAATGTTGGCGTCTT-3'，擴增片段長度為321bp。TRIzol法提取各組細胞總RNA，每個樣本等量取總RNA5μg，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增條件：預變性94℃3 rnin，此后變性90℃45s，退火57℃45s，延伸72℃1 min，共35個循環。結果分析：產物行瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠圖像處理系統得出目的基因及內參灰度值，以內參為標準對比進行半定量分析。

1.3統計學處理 數據資料采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。計量結果用均數±標準差（x±s）表示；采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同處理對細胞增殖的影響72h后，各組細胞數量分別為對照組（15.74±0.67）×106/ml、單放組（6.27±0.91）×106/ml、單藥組（8.27±1.06）×106/ml、聯合組（4.57±0.29）×106/ml。各實驗組細胞數量均明顯減少，較對照組細胞數總體差異均有統計學意義（P<0.05）；各組細胞生長倍增時間分別為對照組（0.76±0.12）、單照組（1.92±0.43）、單藥組（1.68±0.21）、聯合組（2.47±0.19），各實驗組細胞倍增時間延長，較對照組細胞生長倍增時間總體差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2不同處理對細胞凋亡率的影響 檢測結果顯示各處理組細胞凋亡率較對照組均明顯增高，差異均有統計學意義（P<0.05），且聯合組細胞凋亡率均明顯高于單照組與單藥組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3不同處理組中細胞Bax 和Bcl-2的表達變化 各實驗組細胞均較對照組出現Bax mRNA表達增加，Bcl-2mRNA表達減弱以及Bax/Bcl-2比值提高（P<0.05）。此效應在聯合組表現尤為顯著，明顯強于單照組與單藥組（P<0.05），見表3。

3 討論

125I粒子為一種低劑量率的微型放射源，在衰變過程中可同時釋放X線和γ射線，臨床上可將其以不同方式植入腫瘤組織、瘤旁組織、淋巴轉移途徑等部位以治療不同分期的各類惡性腫瘤，能夠在較長的半衰期內（60.1d）對癌細胞進行持續殺傷，相比于傳統體外放射治療，125I粒子具有精度高，創傷小，射線殺傷半徑適當等優點[4]。已知的研究結果表明，低劑量率輻射引發腫瘤細胞損傷可導致其出現兩種死亡形式，即壞死性死亡及凋亡，其中凋亡占主導地位[5]。何啟明等[6]報道，胃癌細胞經125I粒子照射后出現大量凋亡，且Bcl-2與Bax的表達均有所改變，Bcl-2/Bax比值降低，本實驗結果與之相符，因此認為通過調控凋亡相關基因的表達誘導凋亡是125I粒子抗腫瘤的重要作用機制。

EGFR是一種廣泛分布于人體各組織細胞膜上的跨膜多功能糖蛋白，在多數上皮源性腫瘤中呈過度表達與活化狀態。它通過與相應配體包括表皮生長因子、轉化生長因子和肝素結合表皮生長因子等結合后發生自體磷酸化而被激活，進而激發細胞內多條信號轉導通路促進腫瘤細胞分裂、遷徙以及腫瘤新生血管的形成[7]。此外，癌細胞在接受高強度射線刺激后，會出現EGFR反應性再表達，直接致使照射后殘存癌細胞放射抗拒的提升，一方面導致后續輻射治療效果減弱，另一方面使得殘存癌細胞轉移與增殖能力增強。因此，通過阻滯和下調EGFR抑制腫瘤細胞的無序生長以及改善放療預后是很有價值的策略。C225對于EGFR高表達的結直腸癌、頭頸癌、非小細胞肺癌均有較為明確的療效。

Bcl-2是目前備受重視的調控細胞凋亡的基因家族，共分為兩大類，一類是抑制凋亡基因如Bcl-2，另一類是促進凋亡基因，如Bax。特殊情況下細胞內Bcl-2/Bax的相對固定比例被打破，細胞凋亡程度即受到改變。若Bax表達占優勢，則Bcl-2被抑制，凋亡被誘導；反之若Bax表達受抑制，則細胞得以存活。

基于上述理論，筆者認為125I粒子低劑量率持續照射同時聯合C225阻斷EGFR可更有效地發揮抗胃癌作用。一方面，持續照射在較長時間內保證了與C225的協同作用，避免了普通外放射與該藥聯用時的給藥時機問題；另一方面，C225單獨作用的同時降低腫瘤細胞的輻射抗性，提高了粒子照射的治療效率。本實驗證實了這一觀點，細胞增殖及細胞凋亡檢測發現各實驗組MNK-45細胞較對照組均出現明顯生長緩慢及凋亡率增加的現象，其中又以聯合作用組此效應體現得最為顯著。值得一提的是，聯合作用時引起的細胞凋亡率大于單純照射與單純藥物所引起的凋亡率之和。說明不但C225本身可以引起MNK-45細胞的凋亡，而且促進了125I粒子照射下MNK-45細胞凋亡 。

由上可見，臨床上行125I粒子植入治療胃癌時，可以考慮與C225聯合應用，以增強治療效果。但目前關于二者聯合時對正常組織的毒性機制以及細胞敏感性預測因子的相關研究尚缺乏，故使用仍需慎重。因此，該療法的臨床應用意義仍需在動物試驗及臨床實驗中進一步證實。

參考文獻：

[1]卜延志，徐月華，戴旭東.125I粒子術中植入與腹腔內化療聯合應用治療胃癌療效觀察[J].中國醫學研究與臨床，2006，4（6）：50-51.

[2]毛文源，羅開元，邵慶華，等. 125I粒子近距離組織間放射治療胃癌[J].中華胃腸外科雜志，2002，5（2）：112-114.

[3]邵慶華，羅開元，楊鏞，等.胃腸道惡性腫瘤根治術中125碘放射性粒子近距離治療療效觀察[J].中國實用外科雜志，2002，22（9）：541-542.

[4]羅開元.實用組織間植入內放射治療惡性腫瘤學[M]. .1版.北京： 人民衛生出版社， 2008：9-16.

[5]何啟明，伍曉汀. 125I籽源持續照射誘發胃癌細胞株MKN-45凋亡的實驗研究[J].四川大學學報，2009，40（3）：454-458.

[6]Herbst RS. Review of epidermal growth factor receptor biology[J]. Int J Oncol Biol Phys，2004， 59（2）： 21-26.

[7]錢軍，秦叔逵.以表皮生長因子受體為靶點的抗癌新藥-C225[J].中國實用內科雜志，2005，25（8） ：676-678.編輯/哈濤