6—羥基多巴胺損傷早期帕金森病大鼠模型的實驗研究

沈福玉　施建生

摘要：目的 觀察6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine， 6-OHDA）損傷早期帕金森病（Parkinson's disease， PD）大鼠行為學及黑質部位組織學的變化特點。方法 偏側前腦內側束注射6-OHDA，通過阿撲嗎啡誘發旋轉試驗、跨步調節試驗和姿勢部對稱試驗評估注射后24 h、7 d及28 d大鼠行為學的變化；通過免疫組織化學染色觀察黑質部位酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH）陽性細胞計數的變化。結果 6-OHDA組大鼠跨步調節試驗評分減少，姿勢不對稱試驗評分增加，阿撲嗎啡誘發大鼠向損傷對側旋轉，與對照組和假手術組比較統計學差異顯著（P<0.05）；6-OHDA 7 d組、28 d組與24 h組比較，跨步調節試驗評分進一步減少、姿勢不對稱試驗評分進一步增加，阿撲嗎啡誘發旋轉次數增加，有統計學差異（P<0.05）；6-OHDA 24 h組黑質TH陽性細胞減少，與對照組和假手術組比較有統計學差異（P<0.05），7 d組及28 d組TH陽性細胞進一步減少，與24 h組比較統計學差異顯著（P<0.05）。結論 通過阿撲嗎啡誘發旋轉結合非藥物誘發試驗進行行為學評估，可確定偏側前腦內側束注射6-OHDA損傷早期帕金森病動物模型。

關鍵詞：帕金森病；大鼠；6-羥基多巴胺

帕金森病（PD）是常見的中老年人中樞神經系統退行性疾病，其病因及發病機制目前尚不清楚， 研究認為可能與遺傳、環境因素、線粒體功能障礙、興奮性氨基酸、氧化應激、過多的自由基形成及神經生長因子缺乏等有關，是多種機制協同作用的結果[1-2]。偏側6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD動物模型之一，其在癥狀、病理、生化方面的表現與人類PD有不少相似之處，但該模型的損傷程度因6-OHDA的劑量、濃度、注射位點不同而存有爭議，特別是對損傷早期大鼠行為學方面的觀察比較缺乏。本實驗通過觀察6-OHDA損傷早期PD大鼠行為學及黑質部位組織學的變化特點，驗證損傷早期PD大鼠模型的穩定性及可靠性。

1資料與方法

1.1一般資料 選用健康雄性SD大鼠40只， 體重 250～300 g，由南通大學實驗動物中心提供。6-OHDA、抗壞血酸干粉劑、鹽酸阿樸嗎啡（apomorphine）、抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗體均購于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組 40只SD大鼠隨機分為三組：①空白對照組（n=8）；②6-OHDA模型組（n=24）：分為24 h組（n=8）、7 d組（n=8）和28 d組（n=8）3個亞組；③假手術組（n=8）。

1.2.2動物模型 模型組大鼠用復合麻醉劑（含戊巴比妥鈉、丙二醇、硫酸鎂等，0.25 mL/100 g體重）腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回縮反射及角膜反射消失后，將其頭部水平位固定在腦立體定位儀上，剪除顱頂鼠毛，碘酒、酒精消毒皮膚，沿中線切開一長約2cm切口，充分暴露前囟，參照Paxinos & Watson（1996）《大鼠腦立體定位圖譜》確定左側前腦內側束（mfb）三維坐標位置，選取mfb區坐標：前囟后2.8 mm，中線左側2.0 mm，硬膜下8.2 mm。根據注射位點確定鉆顱部位，手術刀尖小心鉆開一直徑約2 mm顱骨孔，微量進樣器緩慢進針至靶點，留針10 min，以9 ng/s的速度注入2 μg/μL 6-OHDA 4 μL（含0.02%抗壞血酸），注射完畢后留針5min，以1mm/min的速度退針。手術完畢，用明膠海綿堵塞顱骨孔，適量青霉素涂敷創口，消毒縫合皮膚，放回籠中飼養。并于24 h、7 d、28 d分別檢測大鼠行為學和組織學的改變。假手術組同法予含0.02%抗壞血酸的生理鹽水4 μL，空白對照組不作任何處理。

1.2.3行為學檢測

1.2.3.1跨步調節試驗[3] 將大鼠身體的后半部分拖起 ，并使大鼠身體重量僅由一側前肢支撐 ，記錄10s內大鼠這一前肢走步次數 ，然后同法檢測另一前肢的情況，以損傷對側前肢行走次數所占比例（損傷對側前肢行走次數/（損傷對側前肢行走次數+損傷側前肢行走次數））為評價指標。

1.2.3.2姿勢不對稱性試驗[4] 握住鼠尾的中后部將其提起，懸空于實驗臺上方約10 cm處，使大鼠頭向下處于垂直狀態， 以其偏離垂直軸不超過10°為垂直位（標準位），記錄大鼠頭或上身左右擺動的情況，以擺動偏離垂直位并再返回到垂直位記數為1次。觀察45 s內大鼠頭或身體轉動的方向和次數，以向損傷對側擺動的次數所占比例（損傷對側擺動的次數/（損傷對側擺動的次數+損傷側擺動的次數））為評價指標。

1.2.3.3阿撲嗎啡誘發旋轉試驗 模型組分別于術后24 h、7 d、28 d于動物腹腔內注射阿撲嗎啡0.5 mg/Kg 誘發大鼠向右側（健側）旋轉，于阿撲嗎啡注射后5 min開始記錄，持續記錄30 min。以24 h誘發旋轉次數<210次/30 min，并于7 d、28 d誘發旋轉次數>210次/30 min為合格模型。

1.2.4組織學檢測

1.2.4.1動物灌注、固定、取材、切片 各組大鼠在最后一次行為學檢測后，用復合麻醉劑麻醉，剪開大鼠胸腔，經主動脈快速灌注生理鹽水（37℃）150～200 mL沖洗，至大鼠肝臟發白，流出液基本無色為止。隨即灌注4%甲醛（4℃）先快速灌注 200 mL，再緩慢灌注300 mL，至頭與四肢均已發硬。斷頭取腦，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4 h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸鹽緩沖液內，存4℃冰箱至腦塊沉入瓶底。取中腦黑質組織塊進行冠狀連續冰凍切片，片厚20 μm。

1.2.4.2抗TH染色 作漂片SABC法染色，具體步驟依次為：冰凍切片用0.01 M（pH7.4）磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，5 min/次。0.3% H2O2抑制內源性過氧化物酶活性， 0.02 mol/L EDTA（95℃）復性（2 min），非免疫的正常羊血清，室溫下孵育30 min，抗TH抗體（1∶1000，抗體稀釋液稀釋），37℃孵育4 h， SABC試劑，室溫下孵育1 h， DAB顯色（陽性產物為棕黃色）。以上各步驟之間均以0.01M（PH7.4）PBS漂洗3次，5 min/次，正常羊血清與抗TH抗體孵育之間不漂洗。顯色后貼片，自然風干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.4.3 TH陽性神經元記數 各組大鼠取包含黑質致密部最明顯的中腦切片，在×100倍顯微鏡下計數兩側黑質有完整細胞體的TH陽性細胞，計算左側與右側黑質TH陽性細胞數的百分比（左側黑質TH陽性細胞數/右側黑質TH陽性細胞數×100% ）。參照蔡文琴等[5]介紹的神經細胞計數方法進行細胞計數。

1.2.5統計學分析 數據結果均使用 SPSS13.0軟件進行統計學分析。數據資料采用均數±標準差（x±s）表示。單因素方差分析進行差異性檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1行為學觀察 對照組及假手術組大鼠經阿撲嗎啡誘發后無旋轉行為，也未出現非藥物誘發的行為學改變。模型組大鼠在注射6-OHDA后數小時即出現損毀側肢體動作減少，身體重心偏向損毀側，并出現身體向損毀側緩慢旋轉，不能進行直線或隨意爬行。

2.1.1跨步調節試驗 對照組及假手術組大鼠兩側前肢10 s內跨步次數基本相同，模型組大鼠在左側前腦內側束注射6-OHDA后24 h跨步調節試驗評分出現有意義減少，7 d及28 d評分進一步減少，見表1。

2.1.2姿勢不對稱試驗 在左側前腦內側束注射6-OHDA后24 h，姿勢不對稱試驗結果顯示模型組大鼠頭部和身體出現向右側轉動次數有意義增加，7 d及28 d姿勢不對稱試驗評分進一步增加，對照組及假手術組大鼠頭部和身體向兩側轉動次數大致相同，見表2。

2.1.3阿撲嗎啡誘發旋轉試驗 在注射6-OHDA后24 h，阿撲嗎啡腹腔注射誘發大鼠以右側后肢為支點，首尾相接向右側旋轉，30 min旋轉次數<210次，7 d和28 d時大鼠阿撲嗎啡誘發旋轉次數>210次/30 min，對照組及假手術組大鼠未誘發出旋轉行為，見表3。

2.2組織學檢測 抗TH染色結果顯示，在左側前腦內側束注射6-OHDA后24 h，大鼠左側黑質TH陽性神經元數目出現有意義減少，高倍鏡下見少部分神經元出現胞體腫脹、核膜界限消失等變性征象，部分神經軸突斷裂、錯亂；7 d和28 d時大鼠左側黑質TH陽性神經元幾乎消失，殘留的TH神經元表現出染色質濃縮壞死現象，神經軸突散在稀疏；模型組大鼠右側黑質TH陽性神經元數目同時也有部分減少；對照組及假手術組大鼠兩側黑質TH陽性神經元無明顯改變，見表4，圖1。

3討論

研究PD需要建立穩定可靠的模型。6-OHDA是一種選擇性中樞兒茶酚胺能神經元毒性物質，具有很強的呼吸鏈抑制作用，偏側6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD模型之一。1970年Ungerstedl[6]首先報道了應用6-OHDA成功制備大鼠偏側PD模型，這種模型能夠在多巴胺能藥物的誘發下產生旋轉行為，以便于判斷模型成功與否。阿撲嗎啡是多巴胺（dopamine，DA）受體激動劑，能夠引起該模型向健側旋轉，這是由于損傷側紋狀體多巴胺含量下降，多巴胺D2受體代償性大量增加，且敏感性增高，出現超敏現象[7]，此時應用DA受體激動劑使損傷側興奮作用占優勢而產生向健側旋轉。

PD的神經保護治療需要早期進行，評估6-OHDA損傷早期大鼠行為學變化，可進一步明確模型是否成功及神經保護性治療是否有效。阿撲嗎啡誘發旋轉試驗結合非藥物誘發的行為學試驗，其評估結果更加有效、可靠[8]。在偏側前腦內側束注射6-OHDA后數小時，大鼠出現肢體動作減少，身體重心偏向損毀側，并出現身體向損毀側不自主旋轉，不能進行直線或隨意爬行，6-OHDA注射后24 h大鼠跨步調節試驗和姿勢不對稱試驗出現有意義改變，腹腔注射阿撲嗎啡后可誘導大鼠在原地向健側旋轉，以健側后肢為支點，首尾相接，形成環狀，但旋轉次數<210次/30 min，提示此時大鼠黑質DA神經元已經受到破壞。免疫組化染色結果也表明偏側前腦內側束注射6-OHDA后24 h，大鼠左側黑質TH陽性神經元減少約30%，部分神經元出現胞體腫脹、核膜界限消失等早期變性征象，部分神經軸突斷裂、錯亂。

偏側前腦內側束注射6-OHDA后24 h大鼠出現行為學和組織學方面的變化，為檢測模型的穩定性和可靠性，實驗設立6-OHDA損傷后7d和28d組。結果顯示：大鼠行為學改變較24 h組更加顯著，阿撲嗎啡誘發旋轉次數>210次/30 min，符合成功PD模型標準；7 d和28 d時大鼠左側黑質TH陽性神經元減少90%。偏側前腦內側束注射6-OHDA后，損傷對側有部分DA能神經元丟失，可能與藥物的滲透作用或經血液循環等有關。

綜上所述，通過早期行為學檢測，可為神經保護性研究確立合格的PD模型，避免了藥物提前干預存在的藥物顯效與模型失敗之間的爭議。

參考文獻：

[1]Cookson M R. The Biochemistry of Parkinson's Disease [J]. Annu Rev Biochem， 2005， 74： 29-52.

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[3]Olsson M， Nikkhah G， Bentlage C， et al. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model：differential effects dopamine agonists and nigral transplants assessed by a new stepping test [J]. J Neuroecience， 1995， 15（5-2）： 3863-3875.

[4]Roghani M， Behzadi G， Baluchnejadmojarad T. Efficacy of elevated body swing testing the early model of Parkinson disease in rat [J]. Physiology & Behavior， 2002， 76（4-5）： 507-510.

[5]蔡文琴，王泊沄.實用免疫細胞化學及核酸分子雜交技術[M].成都：四川科學技術出版社，1994：180-191.

[6]Ugerstedl U， Arbuthnott G. Quantitative reording of rotational behavior in rats after 6-hydroxydopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system [J]. Brain Res， 1970， 24： 485.

[7]何建成， 袁燦興， 衛洪昌.6-羥基多巴胺制備帕金森病大鼠模型的神經行為學特點[J].中國臨床康復，2005，9（29）：68-69.

[8]張耀芬，段德義，徐群淵.6-羥基多巴胺帕金森病大鼠模型的制作和行為學評價[J].解剖科學進展，2005，11（1）：49-50.

編輯/張燕