水曲柳DNA濃度及滴加時間對楊樹花粉管通道法結(jié)實率的影響

杜人杰　曲躍軍　金虎　陶雙勇　鄒威　王慶斌　周冬躍　張翼　付靜　時平

摘要[目的]對適宜的水曲柳DNA濃度及滴加時間進行初步探索，獲得具有水曲柳優(yōu)勢性狀的楊樹植株。[方法]通過花粉管通道法，將攜帶水曲柳基因組的DNA導(dǎo)入楊樹。人工授粉后一定時間在花柱基部進行橫切，把不同濃度DNA溶液滴加到子房切口端，10 d后統(tǒng)計結(jié)實率。[結(jié)果]在同一時間點，隨著水曲柳DNA濃度的增加，結(jié)實率呈現(xiàn)逐漸降低趨勢；隨著授粉與滴加DNA時間的延長，同一濃度下呈現(xiàn)出結(jié)實率先降低后升高趨勢。當(dāng)水曲柳DNA溶液滴加時間控制在人工授粉后6 h左右，DNA濃度為50 μg/ml時是在楊樹上運用花粉管通道法轉(zhuǎn)化水曲柳基因最適宜的條件，結(jié)實率可達17%。[結(jié)論] 滴加時間與外源DNA不同梯度水平對轉(zhuǎn)化結(jié)實率有很大影響。

關(guān)鍵詞水曲柳；花粉管通道；楊樹；結(jié)實率

中圖分類號S792.12文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）22-07323-02

水曲柳材質(zhì)優(yōu)良，耐寒性良好，是珍貴的用材樹種。楊樹是營造短輪伐期工業(yè)原料速生豐產(chǎn)林和城鄉(xiāng)綠化的主要樹種，楊樹早期速生、無性繁殖容易，可迅速種植形成人工林，解決木材問題，但品種老化及生產(chǎn)力低一直是制約楊樹商品林生產(chǎn)力發(fā)展的瓶頸之一，現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因技術(shù)為改良楊樹性狀提供了有效途徑。花粉管通道法導(dǎo)入外源DNA的技術(shù)，由周光宇等（1983）建立并在長期科學(xué)研究中得以發(fā)展。花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿著花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞[1]。該方法具有操作簡便經(jīng)濟、育種時間短等優(yōu)點，已在植物基因轉(zhuǎn)化中初見成效，如棉花、水稻、大豆等作物[1]，目前在楊樹應(yīng)用上只有陳洪偉等（2008）通過花粉管通道導(dǎo)入外源胡楊DNA到白楊中的研究，其他應(yīng)用尚未見報道。筆者利用花粉管通道法將外源水曲柳DNA導(dǎo)入楊樹，對適宜的水曲柳DNA濃度及滴加時間進行初步探索，為獲得具有水曲柳優(yōu)勢性狀的楊樹植株，沖破物種之間的界限，實現(xiàn)物種間的基因傳遞，為后續(xù)的楊樹良種選育研究提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料轉(zhuǎn)基因受體：黑龍江牡丹江青梅試驗站栽植的22年生中牡1號楊（P.deltoides×P.cathayana）的F1代；供體：牡丹江北山栽植的20年生水曲柳（Fraxinus mandshurica Rupr.）。

1.2方法

1.2.1水曲柳DNA的提取。采用大連寶生物公司《植物基因組DNA純化試劑盒（9768）》提取水曲柳DNA，OD260/OD280為1.8～2.0，水曲柳DNA用去離子水溶解。

1.2.2水曲柳DNA的導(dǎo)入。 采集中牡1號楊的雄枝，實驗室水培，挑選飽滿的花藥，收集花粉，室溫晾干，裝入干燥瓶放入4 ℃冰箱備用。

選擇發(fā)育良好、當(dāng)天初開的中牡1號楊雌花，進行人工授粉，授粉后3～24 h在花柱基部進行橫切。在裝有50～400 μg/ml 水曲柳DNA1 000 μl的離心管中，加入1 μl TWEEN20。用移液器吸取混合后的DNA液在子房切面上進行滴加，滴加10 d后，統(tǒng)計結(jié)實率。DNA濃度分別為50、100、200、400 μg/ml，每個處理滴加100個花序；對照DNA濃度為0 μg/ml（已加1 μl TWEEN20），同樣處理100個花序。滴加時間分別為授粉后3、6、12、24 h；每個水平作3次重復(fù)。