LC睲S/MS測定四大南藥中黃曲霉毒素含量

查玉兵等

摘要[目的]采用高效液相色譜-串聯質譜儀（LCMS/MS），在多反應監測（MRM）模式下建立了四大南藥中黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）含量的測定方法。[方法]試樣中的黃曲霉毒素經甲醇/水（70/30）提取，黃曲霉毒素免疫親和柱凈化，液相色譜-串聯質譜法測定，外標法定量。[結果]該方法的檢出限（LOD）為0.2～0.5 μg/kg，線性范圍為0～50 μg/L，相關系數R2均大于0.999；在2～50 μg/kg的添加水平上，4種霉菌毒素平均回收率為78.6%～92.1%，相對標準偏差RSD為0.8%～8.4%。[結論]該方法前處理簡單、快速，靈敏度、準確度和精密度高。

關鍵詞高效液相色譜-串聯質譜；黃曲霉毒素；四大南藥；含量

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-12901-03

Abstract[Objective] The research aimed to develop the determination method of aflatoxin （AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）content in four south medicines in the multiple reaction monitoring （MRM） mode by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （LCMS/MS）. [Method]The drugs were extracted with methanol/water（70/30，V/V），and cleaned up by using beacon aflatoxin column，dissolved in methanol and analysised by LCMS/MS.[Result]The limits of detection（LOD） were 0.2-0.5 μg/kg.The calibration curves were linear between 0 to 50 μg/L，and the correlation coefficient was more than 0.999.The average recoveries ranged from 78.6%-92.1% and RSD was 0.8%-8.4% by addition of 2-50 μg/kg avermectin standards to four south medicines as matrixes. [Conclusion] The proposed method was fast， simple， sensitive and accurate.

Key wordsUPLCMS/MS；Aflatoxin；Four south medicines；Contaminants

檳榔、益智、砂仁、巴戟天為海南盛產的我國四大南藥，檳榔用于驅蟲清積、引氣利尿，益智能溫脾暖胃、固本澀精，砂仁是引氣和中、開胃消食、止痛安胎之良藥，巴戟天則能補氣益精、強筋壯骨、祛風除濕。目前，四大南藥在臨床上應用十分廣泛[1]。然而，藥材在生產、加工、貯藏、運輸的過程中，由于條件和技術簡陋，很容易發生霉變而產生黃曲霉毒素（AFT）。

黃曲霉毒素發現于1960 年，毒性為氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍。AFT可引起肝臟的急慢性損害，同時還對腎臟等其他多種組織器官造成嚴重損害，且具有致癌、致畸、致細胞突變的“三致” 作用[2]。韓國食品醫藥品安全廳（KFDA）發布了有關中藥材中黃曲霉毒素B1限量標準和試驗方法的公告，要求甘草、決明子、桃仁等9味中藥材黃曲霉毒素B1低于10 μg/kg[3] 。泰國允許黃曲霉毒素B1的限量20 μg/kg[4]，我國原外經貿部WM2-2001《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》[5]中AFT 限量標準為小于5 μg/kg。《中國藥典》2010版一部僅對桃仁、胖大海、陳皮等幾味藥材規定AFB1最高限量5 μg/kg，AF（B1+B2+G1+G2）最高限量為10 μg/kg。目前，黃曲霉毒素的測定方法主要有薄層色譜法（TLC）[6]、高效液相色譜法（HPLC）[7]、酶聯免疫吸附分析法（ELISA）[8]以及生物傳感器法等。但由于無法對樣品進行準確的定性和定量分析，且容易出現假陽性等問題，不能作為最終的確證方法。筆者采用超高效液相色譜串聯質譜法測定四大南藥中黃曲霉毒素含量，不僅簡化了前處理步驟，且大大提高了方法的檢出限。

1材料與方法

1.1儀器

Waters ACQUITY UPLCTMTQD MS/MS系統（美國waters）；旋轉蒸發儀R205（瑞士BUCHI公司）；超聲波清洗器（德國ELMA公司）；渦旋混合器（德國IKA公司）；MilliQ純水系統（美國Millipore公司）。

1.2試劑乙腈（色譜純）；甲醇（分析純）；甲酸（色譜純）；乙酸（色譜純）；乙酸銨（色譜純）；乙酸乙酯（分析純）；水為二次蒸餾水；黃曲霉毒素免疫親和柱（柱容量約300 ng 黃曲霉毒素，3 ml）；黃曲霉毒素標準品。

1.3標準溶液的配置稱取適量黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準品，分別用甲醇溶解于25 ml容量瓶中，配成100 μg/ml的標準儲備液，使用時根據需要以流動相稀釋成標準工作液。

分別吸取適量儲備溶液（標準溶液）于同一容量瓶中，用甲醇配制成1.0 μg/ml的混合標準中間液，于4 ℃保存。吸取適量上述混合標準中間液，用乙腈配制成不同濃度的標準系列工作液。

1.4黃曲霉毒素的提取

稱取5.0 g樣品于50 ml 離心管中，加入1 g氯化鈉及50 ml 甲醇-水（70∶30，V/V）高速勻漿1 min，用玻璃纖維濾紙過濾，取20 ml上濾液加入10 ml水，搖勻，備用。

1.5提取物的凈化

精密吸取濾液15 ml，通過免疫親合柱（1～2滴/秒），棄去流出液，用10 ml水分2次洗脫，棄去洗脫液，抽干，再用2.0 ml甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液。過0.2 μm濾膜，供LCMS/MS測定。

1.6色譜質譜條件

色譜柱為UPLC ACQUITY BEH，50×2.1 mm，1.7 μm；流動相為乙腈（A）/ 0.1甲酸水溶液（V/V）。梯度洗脫程序為0～1 min，90%A；1.0～2.2 min，90%～50%A；2.2～3.0 min，50%～90%A；3～4 min，90%A保持1 min。流速為0.2 ml/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μl。離子源為ESI，正離子模式；毛細管電壓4.0 kV；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量800 L/ hr；錐孔反吹氣流量50 L/hr；錐孔電壓40 V；掃描方式為多反應監測（MRM）。用于定性、定量的離子對和相關質譜參數如表1所示。

2結果與分析

2.1提取溶劑的選擇

在試驗過程中，提溶劑的選擇直接影響方法的準確度。黃曲霉毒素易溶于甲醇和乙腈，該試驗分別選用甲醇、乙腈、水、甲醇/水和乙腈/水作為萃取溶劑。試驗證明，用甲醇/水體系比其他溶劑的提取回收率高，比較了甲醇/水在70/30、80/20和90/10時的添加回收率，當甲醇/水為70/30時，4種黃曲霉毒素的回收率最高。所以選取了70/30甲醇/水作為提取溶劑。

2.2液相色譜及質譜條件的選擇

用乙腈作為有機相，在流動相中分別加入了0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mM乙酸銨，結果表明乙腈和0.1%甲酸水溶液作梯度洗脫時，能夠獲得最強的離子豐度，所以最終確定乙腈和0.1%甲酸為流動相。試驗中嘗試了分別采用正、負2種離子模式，發現正離子模式下的離子化效率明顯高于負離子模式。通過全離子掃描（ Full scan）確定4種黃曲霉毒素的選擇離子，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標準溶液的總離子流圖如圖1所示。

2.4實際樣品的檢測

從市場采購了檳榔、益智、砂仁、巴戟天4種南藥，每種采購3 批，然后按照上述方法測定樣品中黃曲霉毒素的含量。結果表明，益智中的黃曲霉毒素含量最高，且所有益智樣品中4種黃曲霉毒素的陽性率均為100%，其中AFB1含量最高的為0.81 μg/kg，遠低于《中國藥典》2010版一部僅對桃仁、胖大海、陳皮等幾味藥材規定AFB1 最高限量5 μg/kg，而4種黃曲霉毒素總量最高的為10.3 μg/kg，稍高于《中國藥典》2010版一部僅對桃仁、胖大海、陳皮等幾味藥材規定AF（B1+B2+G1+G2）最高限量10 μg/kg。檳榔樣品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的陽性率分別為80%、60%、20%和20%，其中AFB1和AFB2含量最高的分別為1.83和1.44 μg/kg，4種黃曲霉毒素總量最高達856 μg/kg。巴戟天中樣品AFB1和AFB2的陽性率均為20%，總量最高為2.01 μg/kg。砂仁樣品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的陽性率均為20%，總量最高為0.56 μg/kg。

3結論

藥材在生產、加工、貯藏、運輸的過程中，容易發生霉變而產生黃曲霉毒素。我國對外貿易合作部發布的藥用植物及制劑進出口綠色行業標準（2001年第4號文）規定部分藥材中黃曲霉毒素AFB1≤5 μg/kg；香港特區政府衛生署公布的中藥材參考標準中規定黃曲霉毒素AFB1≤5 μg/kg，總量≤10 μg/kg；歐洲藥典（EP 6.2）規定黃曲霉毒素AFB1≤2 μg/kg，總量≤4 μg/kg。按照韓國新的許可標準，中藥材中黃曲霉毒素AFB1的含量必須低于10 μg/kg。該項目所建立的四大南藥中黃曲霉毒素分析方法，該方法的檢出限（LOD）為0.2～0.5 μg/kg，完全滿足各國規定的藥材中黃曲霉毒素的限量要求；線性范圍為0～50 μg/L，相關系數R2均大于0999。在2～50 μg/kg的添加水平上，4種霉菌毒素平均回收率為78.6%～92.1%，相對標準偏差RSD為0.8%～84%。利用該方法對四大南藥樣品進行了分析，樣品中黃曲霉毒素AFB1均未超標，但部分藥材中黃曲霉毒素總量有超出歐洲藥典的限量標準。建議有關部門盡快制定我國藥材中黃曲霉毒素AFB1以及總量的限量標準，以加強對藥材的管理。

參考文獻

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