芒果類黃酮磺基轉(zhuǎn)移酶基因克隆及表達(dá)分析

董龍等

摘 要 利用前期芒果逆境差異顯示的基因數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物，從四季芒基因組DNA和cDNA中克隆了1條長為1 208 bp的基因片段。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)儆陬慄S酮磺基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid sulfotransferase）基因，在第71-334個(gè)氨基酸中包含一個(gè)保守的Sulfotransferase結(jié)構(gòu)域，命名為芒果類黃酮磺基轉(zhuǎn)移酶基因（MiST）。該基因編碼341個(gè)氨基酸，分子量為85.14 ku，等電點(diǎn)為5.09，不含內(nèi)含子，在不同芒果品種之間其核苷酸和氨基酸序列均高度保守。半定量表達(dá)模式分析顯示，該基因在四季芒莖、葉、花和果中均有表達(dá)，但在謝花后20 d的小果和謝花后40 d的中果中的表達(dá)量較高，表明該基因可能與芒果果實(shí)中黃酮的生物合成有關(guān)。

關(guān)鍵詞 芒果；類黃酮磺基轉(zhuǎn)移酶基因；表達(dá)分析

中圖分類號 S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning and Expression Analysis of a Flavonoid Sulfotransferases Gene from Mango（Mangifera indica）

DONG Long1， LUO Cong1*， HE Xinhua1，2**， HU Ying1， YU HaiXia1

1 College of Agronomy， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004，China

2 Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract Based on the early differential gene expressions database of mango stress samples， a 1 208 bp sequence was obtained. Bioinformatics analysis showed that the gene belonged to flavonoid sulfotransferase. It was named as M. indica flavonoids sulfotransferase gene（MiST） due to existing a conservative sulfotransferase domain structure between 71-334 amino acid sequence. The gene coded 341 amino acids with an estimated molecular weight and isoelectric point of 85.14 Ku and 5.09， respectively. No introns were found in the MiST DNA sequences， but the nucleotide and amino acid sequences of MiST DNA sequences were highly conserved between different mango varieties. Semi-quantitative analysis showed that the MiST gene was expressed in stems， leaves， flowers and fruits in mango， but the gene expression level in the tissue of small fruits（20 days after the fallen petal） and middle fruits（40 days after the fallen petal）was higher than that of the other tissues. These results indicted that MiST gene might be play an important role in flavonoid biosynthesis in mango fruit.

Key words Mango；Flavonoid sultransferase gene；Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.016

黃酮類化合物（Flavonoid，又稱類黃酮）是一類廣泛存在于植物中的多酚類天然產(chǎn)物，其對植物的生長、發(fā)育、開花和結(jié)果以及抵御異物入侵起著重要的作用[1]。黃酮類化合物形成后不僅有糖基化修飾，同時(shí)還存在酰基化和硫酸化修飾，從而導(dǎo)致黃酮類化合物種類及其功能的多樣性[2]。此類化合物對人類具有保護(hù)心腦血管、降低膽固醇、抗氧化、抗菌、抗過敏、抗炎癥等多種生物活性及藥理作用[3-7]；而對植物其具有抗紫外輻射、吸引授粉昆蟲、決定花的顏色、抵御低溫脅迫、增強(qiáng)植物的抗病性等功能[2， 8-9]。而磺基轉(zhuǎn)移酶具有底物結(jié)合和催化的功能，在調(diào)控植物解毒、植物的生長發(fā)育等方面有重要作用。同時(shí)，多個(gè)類黃酮磺基轉(zhuǎn)移酶基因催化黃酮硫酸酯的生物合成[1]，在植物、動(dòng)物、細(xì)菌中硫酸鹽代謝中也具有重要作用[2，10-11]。這些與黃酮類化合物的硫酸化修飾關(guān)系密切。目前，類黃酮磺基轉(zhuǎn)移酶基因在動(dòng)物和人類中研究比較深入，而在植物中研究相對較少，在擬南芥[2，12-13]、菊花[14]和甘藍(lán)型油菜[15]中有報(bào)道，在芒果等木本植物中的研究鮮有報(bào)道。

芒果是重要的熱帶水果之一，廣受消費(fèi)者的歡迎，并且其果肉富含天然的抗氧化類物質(zhì)，如抗壞血酸、類胡蘿卜素、黃酮等[16]。目前黃酮類化合物的生物合成一直是植物次生代謝基因工程中一個(gè)重要研究課題，芒果類黃酮已有生理生化方面的研究報(bào)道[17]，但分子生物學(xué)方面尚未見相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)以四季芒逆境脅迫樣品的差異顯示數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選并克隆獲得一個(gè)基因，經(jīng)比對確認(rèn)該基因?yàn)槊⒐慄S酮磺基轉(zhuǎn)移酶基因（Mangifera indica flavonoid sulfotransferase，MiST），對其cDNA和DNA全長序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并分析其在四季芒不同組織中的表達(dá)模式，旨在為芒果黃酮類化合物的生物合成機(jī)制和類黃酮磺基轉(zhuǎn)移酶基因后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：四季芒葉片、花、果實(shí)、莖以及凱特、臺(tái)農(nóng)一號和桂熱82號植株的葉片；供試材料均采自于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院果樹標(biāo)本園。

試劑和儀器：M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、EX Taq DNA聚合酶、氨芐青霉素、pMD18-T 載體均購自大連TaKaRa公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖、引物合成以及測序均來自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自杭州博日公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA及RNA的提取 四季芒、凱特、臺(tái)農(nóng)一號和桂熱82號芒果成熟葉片基因組DNA的提取采用改良CTAB法[18]。芒果總RNA的提取采用熱硼酸法。分別提取四季芒老葉、嫩葉、初花、盛花、小果（謝花后20 d）、中果（謝花后40 d）、大果（謝花后60 d）、嫩莖、老莖等材料的總RNA。最后用紫外分光光度計(jì)測定其純度和濃度并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.2.2 cDNA 第一鏈的合成 以AUP1：GGCCAC

GCGTCGACTAGTAC（T）18為逆轉(zhuǎn)錄引物，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，合成方法步驟參照說明書進(jìn)行。用紫外分光光度計(jì)測定逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的濃度，并用瓊脂糖電泳檢測逆轉(zhuǎn)錄效果，最后把cDNA第一鏈產(chǎn)物配成200 ng/μL標(biāo)準(zhǔn)濃度用于PCR擴(kuò)增。

1.2.3 芒果MiST同源基因全長克隆 課題組前期對四季芒不同逆境脅迫處理樣品進(jìn)行基因差異顯示研究，獲得芒果MiST同源基因的全長序列。在MiST基因的起始密碼子附近設(shè)計(jì)引物QSTu，下游引物為逆轉(zhuǎn)錄加尾引物3side，用于芒果MiST同源基因cDNA全長的克隆；在終止密碼子附近設(shè)計(jì)下游引物QSTd，與上游引物QSTu進(jìn)行DNA擴(kuò)增，獲得芒果MiST同源基因DNA全長序列。芒果ST同源基因cDNA擴(kuò)增PCR體系如下：總體積為25 μL，其中buffer 2.5 μL；cDNA 1 μL；上下游引物各為1 μL；dNTP 0.5 μL；Dream Taq聚合酶0.16 μL；ddH2O 18.84 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：95 °C預(yù)變性5 min；95 °C變性40 s；57 °C退火40 s；72 °C延伸90 s；共38個(gè)循環(huán)；72 °C延伸8 min。芒果ST同源基因DNA擴(kuò)增PCR體系與cDNA擴(kuò)增體系相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用Biospin Gel Extraction Kit回收克隆的目的片段，膠回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐霉素篩選陽性菌落，經(jīng)PCR驗(yàn)證后，送上海寶生物工程有限公司測序。合成的引物序列如下：

QSTu： CAATGGTTTACACAAGAACCCAAT

QSTd： TGTTCGTCCTGACTCTTCCTAC

3side： GGCCACGCGTCGACTAGTAC

1.2.4 芒果MiST同源基因序列分析 將芒果MiST同源基因提交美國國立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），用Blast檢索基因的相似性；用BioXM2.6進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測；利用在線分析軟件 Protparam分析氨基酸序列的理化性質(zhì)；利用在線分析工具GENSCAN對該基因的核苷酸序列進(jìn)行分析；利用在線分析工具SOSUI的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對其蛋白進(jìn)行預(yù)測；用ScanProsite和SMART對氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測；用GOR4分析MiST蛋白的二級結(jié)構(gòu)；用3D-JIGSAW對氨基酸的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，并用RasMol2.7進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)顯示；用MEGA5.0軟件，選擇連接近鄰算法構(gòu)建多物種MiST同源基因推測蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 芒果MiST基因在不同組織器官的表達(dá)分析

通過半定量RT-PCR方法探討芒果MiST基因在四季芒不同組織器官中的表達(dá)情況。內(nèi)參基因選用芒果Actin1基因[19]。半定量PCR體系如下：總體系為25 μL，包含buffer 2.5 μL；cDNA 1 μL；上下游引物各為1 μL；dNTP 0.5 μL；Dream Taq聚合酶0.16 μL；ddH2O 18.84 μL）。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。內(nèi)參引物及半定量特異引物設(shè)計(jì)如下所示：

半SActinU1： GTTTCCCAGTATTGTGGGTAGG

半SActinD1： AGATCTTTTCCATATCATCCCAGTT

半ST2U： TTAGCCACAATACCGAAATCAGG

半ST2D： CTCCCAAAATGGACCGAACCC

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果MiST基因全長克隆

利用引物QSTu和QSTd對四季芒混合cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得長度為1 208 bp的MiST基因全長cDNA序列及推測氨基酸序列（圖1），基因登陸號為HQ586002。

2.2 序列分析

MiST基因序列全長1 208 bp，包括一個(gè)1 023 bp的開放閱讀框，編碼341個(gè)氨基酸（圖1）。利用分子生物學(xué)分析軟件BioXM 2.6對克隆得到的4個(gè)芒果品種的MiST基因DNA序列進(jìn)行比對結(jié)果表明，這4個(gè)芒果品種的MiST基因序列高度保守，有8個(gè)位點(diǎn)的堿基差異，翻譯的氨基酸序列有5個(gè)位點(diǎn)的氨基酸不一致。

MiST基因的核酸和氨基酸序列分別在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)該基因的核酸序列與楊樹（Populus trichocarpa）同源性較高，氨基酸序列與可可樹（Theobroma）同源性較高。利用在線分析軟件Protparam對芒果MiST的氨基酸序列理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)的分子式為C3152H5283N1023O1322S202，分子質(zhì)量為85.14 Ku，等電點(diǎn)為5.09。編碼蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）為36.33，總平均疏水性為0.748，預(yù)測為穩(wěn)定的疏水蛋白。預(yù)測該蛋白的預(yù)估半衰期為4.4。

利用在線分析軟件對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析結(jié)果如表1，其中用四季芒的cDNA和gDNA克隆得到ST基因的大小和序列比對相同，表明該基因不含有內(nèi)含子。這和軟件GENSCAN分析結(jié)果一致，該基因只有一個(gè)外顯子。由表2可知，該蛋白具有較多的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，推測該基因可能參與糖代謝控制，其他基因的表達(dá)調(diào)控。通過不同在線分析軟件對MiST蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)（圖2）的分析比較，結(jié)果基本吻合，說明軟件分析結(jié)果具有可信度。

用MEGA5.0軟件對芒果MiST蛋白的氨基酸序列與多種不同植物ST蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果如圖3，發(fā)現(xiàn)芒果MiST蛋白與可可樹的ST蛋白關(guān)系最近。

2.3 芒果不同組織不同發(fā)育時(shí)期MiST表達(dá)水平差異分析

以芒果Actin1基因?yàn)閮?nèi)參基因（32個(gè)循環(huán)），采用半定量RT-PCR的方法分析芒果MiST基因在嫩莖、老莖、嫩葉、老葉、初花、盛花、小果、中果、大果（約8成熟果實(shí)）中的表達(dá)模式。其中內(nèi)參基因和目的基因半定量擴(kuò)增的目的條帶大小分別為168 bp、423 bp。由圖4可知，芒果MiST基因在莖、葉、花、果中均有表達(dá)，在嫩葉、老葉和大果的表達(dá)量較低，在小果和中果中的表達(dá)量比其他組織均高，但在嫩莖、老莖、初花和盛花的組織里面表達(dá)基本一致維持在中等水平。說明MiST基因在芒果地上部分的每個(gè)器官都有表達(dá)，但表達(dá)量有明顯差異。

3 討論與結(jié)論

目前發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物已超過1萬多種，由于黃酮類化合物種類繁多和具有廣泛的藥理活性，使國內(nèi)外許多學(xué)者對其產(chǎn)生了濃厚的興趣。

在模式植物擬南芥中已發(fā)現(xiàn)18個(gè)ST基因成員[2]，但不同ST基因成員其表達(dá)模式及其功能存在很大的差異。RaRO47擬南芥的一個(gè)ST基因，其在兩2小苗中表達(dá)水平最高，而在根中不表達(dá)，在4周和5周的蓮座葉和花中少量表達(dá)，在第7周的成熟果莢中也表達(dá)，重金屬、茉莉酸甲酯、水楊酸以及微生物浸染均誘導(dǎo)其表達(dá)[13]。本試驗(yàn)中，芒果MiST基因在四季芒莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期的果中均有表達(dá)，但不同樣品之間表達(dá)量存在明顯差異，其中在小果和中果中表達(dá)量最高，其次是初花、盛花、嫩莖、老莖，在老葉、嫩葉和大果中的表達(dá)量最低，芒果MiST基因與擬南芥的AtST基因表達(dá)模式存在差異。Maciel等[17]對3個(gè)不同芒果品種不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中黃酮含量進(jìn)行測定分析結(jié)果顯示，在未成熟果實(shí)中的黃酮含量顯著高于即將成熟果實(shí)和已成熟果實(shí)。而本試驗(yàn)中芒果MiST基因在未成熟果實(shí)中的表達(dá)水平顯著高于即將成熟果實(shí)，說明芒果MiST基因的表達(dá)模式可能與黃酮類化合物的生物合成和分布存在密切關(guān)系。

本試驗(yàn)首次從四季芒中分離克隆到一個(gè)芒果MiST基因cDNA和DNA全長序列，對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的磺基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，并且含有較多的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，推測該基因可能對糖代謝調(diào)控、其他基因功能調(diào)控等有關(guān)，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。利用半定量RT-PCR方法對該基因在芒果不同組織中的表達(dá)特性進(jìn)行了比較分析，為進(jìn)一步深入研究芒果黃酮類物質(zhì)在不同組織中生物合成的理化指標(biāo)提供參考，同時(shí)該研究結(jié)果也可為該基因的表達(dá)途徑、生物合成機(jī)制、生物活性等方面提供有用信息，從而能更充分地利用芒果黃酮類物質(zhì)為植物抗性防御和人類疾病研究服務(wù)。

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