正交優化芒果SRAP擴增體系及引物篩選

應東山等

摘 要 利用正交實驗設計，對芒果SRAP-PCR反應的5因素（Mg2+、dNTPs、模板DNA、引物和Taq DNA聚合酶）4水平的擴增效果進行研究，確立適合芒果SRAP-PCR反應的最佳體系。總體積25 μL的SRAP-PCR優化的最佳反應體系中含有：并運用該體系從153對引物組合中初步篩選出50對SRAP引物組合。建立的SRAP標記可為芒果遺傳多樣性、分子標記及輔助育種等提供研究基礎。

關鍵詞 芒果；SRAP；正交設計；體系優化

中圖分類號 S667.7 文獻標識碼 A

Optimized Conditions of Sequence-related Amplified

Polymorphism（SRAP） System and Primer

Screening for Mango

YING Dongshan， LUO Haiyan， WANG Ming， LI Liping，

WANG Qinfei， ZHU Min， CHEN Yeyuan*

Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory

of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract An orthogonal design was used to optimize the SRAP amplification system including five factors（the concentration of Mg2+， dNTPs， template DNA， primer and Taq DNA polymerase）at four levels for mango. The optimum SRAP-PCR system was established，namely 25 μL reaction system containing 2.5 μL 10×buffer、20 ng template DNA， 2.5 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs， 0.4 μmo1/L Primer， 1.5 U Taq DNA polymerase. Under the optimum reaction conditions， 50 out of 153 SRAP primer combinations were selected. The results also indicated that the optimized conditions of SRAP could provide an effective means for the research of genetic diversity， molecular marker and auxiliary breeding in mango.

Key words Mango；SRAP；Orthogonal design；Optimization system

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.015

近年來，分子標記分析技術在果樹種質資源遺傳差異分析和種質資源研究中得到廣泛應用。利用分子標記進行遺傳學研究是理解遺傳傳遞的強有力的途徑，分子標記所揭示的遺傳多態性能直接反映基因組DNA間的差異[1]。芒果（Mangifera indica L.）在中國已有1 300多年的栽培歷史[2]，經過幾十年的種質資源的收集和引種，中國的芒果種質資源相對豐富，主要分布在海南、廣西、廣東、云南等地，并且芒果具有較高的營養價值。亞洲東南部是芒果重要的起源地之一，據Kostermans等[3]報道，芒果屬有58個種和11個未確定種（中國的冬芒、桃葉芒和云南的野芒屬于不確定種），說明中國也是芒果的起源地之一。這些未確定種的野生芒果與普通芒果有著明顯的差異，其食用價值也遜于普通芒果，但一些特殊的性狀，可以作為種質加以保存，待品種改良作為育種材料。相關序列擴增多態性（Sequence-related amplified polymorphism， SRAP）是一種基于PCR的新型標記系統，顯性標記， 由美國加州大學蔬菜作物系Li等于2001年提出[4]，也稱基于序列擴增多態性（Sequence Based Amplified Polymor-phism， SBAP）[5]。該標記具有簡便、高效、產率高、高共顯性、重復性好、易測序、便于克隆目標片段的特點。目前，在南瓜[6]、余甘子[7]、麗雜花苜蓿[8]等作物上有關SRAP標記體系優化及其在木瓜[9]、甜瓜[10]、山核桃[11]、楊樹[12]等作物的遺傳多樣性分析、菜薹雜交種指紋圖譜構建[13]和甘薯[14]、茄子[15]遺傳圖譜構建等方面得到了應用。

本研究運用正交設計優化PCR反應體系，該種設計具有均衡分散和整齊可比的特點，能達到事半功倍的效果，快速找到最佳組合。目前，有關SRAP在芒果上的研究還未見報道。本研究采用L16（45）正交設計對影響芒果SRAP反應體系的模板DNA、引物、Taq酶、dNTPs、MgCl2等5個因素4個水平進行篩選，以快速建立較為完整可靠的芒果最佳SRAP-PCR反應體系，為利用SRAP標記分析芒果遺傳多樣性、分子標記及輔助育種等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

芒果葉片取自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所的農業部儋州芒果種質圃；Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、標準分子量DNA（DL 2 000 Marker）購自Takara公司；引物來自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

芒果總DNA提取參考Kit等研究的改良CTAB法[16]。

1.2.1 SRAP擴增反應體系優化 采用L16（45）正交表設計試驗，對模板DNA、引物、dNTPs、Taq聚合酶和MgCl2等5個影響因素設置4個水平16個組合。隨機選取引物組合ME2EM9引物對進行正交試驗（引物序列見表1），試驗設計見表2和表3。

1.2.2 PCR擴增 PCR擴增的程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，35 ℃復性1 min，72 ℃延伸1.5 min，5個循環；94 ℃變性45 s，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸8 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物于BIO-RAD凝膠成像系統拍照保存。

2 結果與分析

2.1 芒果基因組DNA的提取質量

從芒果基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳結果可見其主帶清晰，沒有降解現象。使用分光光度計檢測OD260/OD280在1.8～2.0的范圍內，DNA濃度在50～200 ng/μL之間，說明提取的芒果基因組DNA純度高，無蛋白質及其他雜質污染，滿足SRAP標記對基因組DNA的純度要求。

2.2 SRAP-PCR正交直觀分析

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