水稻HLCMS細胞質雄性不育基因的體外轉錄及Northern Blot檢測

華宇峰　劉京　王春臺　劉學群　譚艷平

摘要[目的]通過基因克隆和體外轉錄技術獲得水稻紅蓮型細胞質雄性不育（HLCMS）不育系粵泰A（YTA）中的2個細胞質雄性不育基因orf216和orfH79的RNA，為Northern Blot檢測提供陽性定量標準品，并可作為凝膠阻滯試驗的底物，用于研究與恢復基因編碼產物的相互作用，從而為闡釋不育基因與恢復基因的相互作用分子機制奠定基礎。[方法]以紅蓮型胞質雄性不育基因orf216和orfH79的特異引物，利用不育系YTA為材料，PCR擴增獲得相應片段，分別連接至pGEM-T Easy質粒并篩選陽性重組質粒，測序鑒定后酶切線性化，補平粘性末端，以rN4為底物、用依賴于DNA的 RNA聚合酶進行體外轉錄，轉錄產物用DNase處理除去DNA模板，純化并測定RNA濃度，并用Northern Blot 驗證。[結果]獲得了細胞質雄性不育基因orf216和orfH79各自的RNA，經檢測orf216濃度為1.286 μg/μl，A260/A280為2.01；orfH79濃度為1.006 μg/μl，A260/A280為2.10。[結論]運用體外轉錄技術獲得的RNA片段條帶單一，純度較高，可用于體外大量獲取目的RNA。

關鍵詞水稻；紅蓮型細胞質雄性不育；體外轉錄；Northern Blot

中圖分類號S511；Q37文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03497-02

基金項目國家自然基金項目（31170296）。

作者簡介華宇峰（1988- ），男，湖北黃岡人，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學研究。*通訊作者，副教授，碩士生導師，博士，從事水稻功能基因方面的研究工作。

植物細胞質雄性不育（Cytoplasmic Male Sterile，CMS）現象在高等植物中普遍存在，是指植物雄性器官喪失功能，而雌性器官發育正常，表現為母性遺傳和花粉敗育的生物學現象[1]。Levings最早報道玉米CMS與細胞質的線粒體基因組異常有關，并以此提出線粒體DNA是導致CMS產生的載體[2]。在大多數情況下，CMS植株花粉敗育的發生與線粒體基因組分子內或分子間頻繁重組所形成的嵌合基因有關[3]，這種線粒體基因組的非正常重組產生嵌合開放閱讀框最終導致了花粉敗育[4]。CMS導致的花粉敗育可以被恢復基因Rf所恢復。CMS/Rf系統減少了手工去雄的工作程序，因此，其在商業用雜交種子生產過程中就顯得尤為重要。CMS除了在農業上的重要性之外，研究CMS的特性也為解析植物中線粒體基因和核基因在遺傳上的相互作用帶來了方便。

Boro II（BT）、Honglian（HL）和Wild abortive（WA）是主要的3種胞質雄性不育類型，均用于三系雜交水稻的培育[5]。易平等以atp6為探針，采用同源系列法，證明了HLCMS線粒體基因組中atp6orfH79構成的嵌合基因與CMS有關[6]。liu等克隆了一個與HLCMS相關的基因片段HLsp1[7]。李丕順通過TAILPCR獲得HLsp1側翼序列，并預測其下游有一個編碼216個氨基酸的開放閱讀框orf216[8]。陳為等發現orf216的表達能導致花粉敗育[9]。

體外轉錄技術是在體外條件下合成RNA的過程。其基本原理是將目的基因片段連接到帶有噬菌體啟動子的克隆載體下游，以構建好的質粒DNA或其線性化片段為模板，用依賴于DNA的RNA聚合酶，在4種核糖核酸存在條件下，體外轉錄生成目的RNA。現已成為一種分子生物學技術，用于制備RNA，目前已經有商業化的試劑盒銷售。應用體外轉錄體系合成的單鏈RNA可用于研究RNA的加工、RNA結構特性及其翻譯；還可用于合成RNA雜交探針，靈敏度極高，特異性強，優于切口平移法獲到的探針[10]。筆者通過基因克隆和體外轉錄技術，獲得水稻紅蓮型細胞質雄性不育（HLCMS）不育系粵泰A（YTA）中的2個雄性不育基因orf216和orfH79各自對應的mRNA，以期為進一步研究orf216的分子作用機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。HLCMS不育系YTA植株和大腸桿菌DH5α，均由中南民族大學武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室提供，克隆載體pGEMT Easy Vector，購自Promega公司。

1.1.2主要試劑。限制性內切酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker和T4 DNA連接酶，購自TAKARA公司；T4 DNA 聚合酶，購自碧云天公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自Axygen公司；SP6 RNA體外轉錄試劑盒，購自Promega公司；North2South？Biotin Random Prime Labeling Kit、North2South Chemiluminescent Hybridization和Detection Kit，均購自Thermo scientific公司；其他試劑均為國產試劑分析純，市售。

1.2方法

1.2.1引物設計[6]。根據易平等發表的orfH79序列設計引物orfH79F/orfH79R，根據實驗室克隆的orf216序列設計引物orf216F/orf216R。引物由南京金斯瑞公司合成。

1.2.2載體構建。取新鮮的水稻YTA葉片，用CTAB法提取基因組DNA，分別用orfH79和orf216的序列引物擴增基因組DNA，獲得orfH79和orf216目的片段。將片段分別與克隆載體pGEMT Easy Vector 在體外進行連接，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于藍白斑篩選平板上，于37 ℃恒溫培養箱光照培養過夜。挑取白色菌落擴大培養，SDS堿裂解法提取培養菌株質粒DNA，并用PCR擴增檢測其是否為陽性，檢測為陽性者送南京金斯瑞公司測序驗證。

1.2.3體外轉錄。用限制性內切酶NcoI將測序正確的質粒DNA進行酶切，酶切產物純化后用T4 DNA 聚合酶將粘性末端補平，再一次純化，得到可用于體外轉錄的線性質粒DNA。按照SP6 RNA體外轉錄試劑盒說明書配制體外轉錄體系，進行體外轉錄。轉錄結束后，用RNasefree DNase消化模板質粒DNA，純化產物，分別得到orfH79 mRNA和orf216 mRNA。nano drop儀（Thermo scientific公司，Nano Drop 2000）測定RNA濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA產物。

1.2.4Northern Blot檢測。應用Northern Blot方法，利用生物素標記的寡聚核苷酸作為探針，檢測所得到的RNA是否為特異的目標RNA。

2結果與分析

2.1載體構建以水稻紅蓮型細胞質雄性不育（HLCMS）不育系粵泰A（YTA）為材料，利用特異引物進行PCR擴增分別得到orfH79和orf216目的片段，轉化大腸桿菌感受態細胞，提取質粒DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對質粒DNA進行特異引物PCR擴增，擴增結果為陽性者送南京金斯瑞公司測序，測序結果均正確。

3討論

基因的體外轉錄體系現在已經廣泛用于RNA的制備。通過體外轉錄，可以獲得多種RNA，包括SiRNA、tRNA及其他類型的RNA，用于研究基因的表達調控，以及研究RNA的結構和功能等。