roGFP1探針在玉米幼胚中響應(yīng)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)改變的初步研究

吳佳梅　劉曉寧　趙軍

摘要[目的]建立roGFP1探針響應(yīng)玉米體內(nèi)氧化還原狀態(tài)變化的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。[方法]首先利用基因槍介導(dǎo)玉米幼胚轉(zhuǎn)化法瞬時(shí)表達(dá)roGFP1基因，利用激光共聚焦顯微鏡405和488 nm激發(fā)光通道對(duì)10 mmol/L H2O2和2 mmol/L DTT溶液處理下的幼胚進(jìn)行510 nm的GFP熒光成像，后通過ImageJ處理圖像和分析熒光比值[405/488 nm]；同時(shí)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米幼胚轉(zhuǎn)化法開展roGFP1基因的玉米穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，進(jìn)行Southern Blot鑒定和熒光顯微鏡觀察。[結(jié)果]在玉米幼胚瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，經(jīng)10 mmol/L H2O2處理后，roGFP1探針的熒光強(qiáng)度比值[405/488 nm]由原來的0.844升高至1.837，而在2 mmol/L DTT溶液處理下的熒光強(qiáng)度比值下降至0.911；經(jīng)Southern Blot鑒定和GFP熒光檢測(cè)獲得了roGFP1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。[結(jié)論]在玉米幼胚瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，roGFP1探針能夠響應(yīng)由外源氧化還原劑引起的體內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變；獲得了表達(dá)roGFP1的轉(zhuǎn)基因玉米植株。

關(guān)鍵詞roGFP1；熒光強(qiáng)度比值；玉米；瞬時(shí)表達(dá)；穩(wěn)定轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）12-03491-03

作者簡(jiǎn)介吳佳梅（1990- ），女，江蘇常州人，碩士研究生，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)。

玉米是我國(guó)重要的糧食作物和飼料來源，自然條件下，干旱、低溫、高鹽等非生物逆境制約了玉米的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）在植物遭受非生物逆境時(shí)大量積累[1]，曾一度被認(rèn)為是有氧代謝過程中具有毒性的副產(chǎn)物。然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，活性氧作為不可或缺的成分參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及各種脅迫反應(yīng)，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)過程中一種重要的信號(hào)分子[1]。ROS的作用機(jī)制成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)，利用植物的ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在提高擬南芥、紫花苜蓿、小麥和水稻等的抗逆性研究上取得了較大進(jìn)展[2，13-14]，而測(cè)定植物體內(nèi)ROS含量的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于研究植物ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。以往通常使用單態(tài)氧（Singlet Oxygen Sensor Green，SOSG）探針，超氧化物陰離子（Dihydroethidium，DHE）探針，二氫羅丹明（Dihydrorhodamine 123，DHR）染料，Amplex Red試劑，OxyBurst green試劑和Dihydrodichlorofluorescein（H2DCF）等熒光探針來測(cè)定植物體內(nèi)ROS含量[3]，但是這些方法都存在著諸多不足。一方面，由于不可逆性，無(wú)法得知植物體內(nèi)ROS含量的動(dòng)態(tài)變化；另一方面，探針自身也存在潛在的問題，比如當(dāng)OxyBurst green接觸到氧氣時(shí)就會(huì)被氧化[4]。Hanson[5]等對(duì)野生型綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）進(jìn)行改造后得到氧化還原敏感的roGFP1 biosensor （C48S，S147C和Q204C），在氧化環(huán)境下，roGFP1的147位和204位的半胱氨酸殘基形成二硫鍵[6]，由于生色團(tuán)的中性電子和陰離子之間的內(nèi)在平衡，roGFP1探針在400 nm和475～490 nm的激發(fā)光下的熒光強(qiáng)度比值發(fā)生改變，這種熒光強(qiáng)度比值法僅受激發(fā)光的影響，從而消除了由探針濃度、光漂白以及組織厚度等引起的誤差[5]。roGFP探針在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能夠響應(yīng)氧化還原狀態(tài)改變[5，7]得到證實(shí)后，被廣泛應(yīng)用于擬南芥[8-9]、煙草葉肉細(xì)胞[10]、酵母[11]和小鼠表皮細(xì)胞[12]中。

前人對(duì)roGFP探針的研究主要集中在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和擬南芥等模式植物細(xì)胞中，在作物細(xì)胞中的研究鮮有報(bào)道。探究roGFP 探針能否響應(yīng)玉米體內(nèi)的氧還改變對(duì)于進(jìn)一步研究玉米R(shí)OS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)、提高玉米抗逆性具有重要意義。筆者利用玉米幼胚瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)檢測(cè)roGFP1探針的熒光強(qiáng)度比值[405/488 nm]是否響應(yīng)動(dòng)態(tài)的氧化還原環(huán)境，然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米幼胚轉(zhuǎn)化法創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，旨在為規(guī)模化鑒定ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因提供直觀便捷的檢測(cè)工具。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。雜交種Hi II和自交系綜31玉米幼胚。

1.1.2供試菌株以及載體。大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌C58C1由實(shí)驗(yàn)室保存；含有9zf（-）PubiTnos載體的DH5α大腸桿菌菌株由實(shí)驗(yàn)室保存；pCAMBIA1304P35SroGFP1 Tnos載體，由Keni Jiang惠贈(zèng)。

1.1.3主要儀器。PTC0200型PCR儀和PDS1000/He臺(tái)式基因槍，購(gòu)自BioRad公司；LSM 700激光共聚焦顯微鏡和HAL 100熒光顯微鏡，購(gòu)自ZEISS公司。

1.1.4主要試劑。限制性內(nèi)切酶，購(gòu)自New England Biolabs（NEB）公司；Taq DNA聚合酶和dNTP等試劑，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；引物合成及測(cè)序，由生工生物工程（上海）有限公司完成；纖維素酶和離析酶，均購(gòu)自日本Yakult Pharmaceutical公司；甘露醇、PEG以及一些常用試劑，均購(gòu)自Amresco公司。

1.2方法

1.2.1roGFP1基因表達(dá)載體的構(gòu)建。按照?qǐng)D1的方法構(gòu)建roGFP1基因表達(dá)載體9zf（-）PubiroGFP1Tnos和pCAMBIA1304PubiroGFP1Tnos；用NcoI和Afl II雙酶切pCAMBIA1304P35sroGFP1Tnos質(zhì)粒獲得roGFP1片段，同時(shí)用EcoR V酶切9zf（-）PubiTnos獲得大片段，roGFP1roGFP1片段經(jīng)Klenow聚合酶補(bǔ)平后和9zf（-）PubiTnos回收片段經(jīng)酶連后獲得9zf（-）PubiroGFP1Tnos載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序，于-80 ℃保存陽(yáng)性克隆。9zf（-）PubiroGFP1Tnos質(zhì)粒經(jīng)Bam HI和Afl II酶切后獲得ubiroGFP1片段，用Bam HI和Afl II酶切pCAMBIA1304P35s roGFP1Tnos后獲得大片段，將ubiroGFP1和pCAMBIA1304P35sroGFP1Tnos回收片段酶連后獲得pCAMBIA1304 PubiroGFP1Tnos，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序后，于-80 ℃保存陽(yáng)性克隆。

圖1roGFP1基因的玉米表達(dá)載體構(gòu)建流程1.2.2玉米幼胚瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的建立。以Hi II雜交系授粉后20 d的玉米幼穗為材料，經(jīng)過5% NaClO處理后剝幼胚，將幼胚用MS清洗2次后轉(zhuǎn)移至固體高滲培養(yǎng)基中；用10 μl金粉包裹1 μg質(zhì)粒制成微彈；轟擊幼胚過程按照基因槍說明書進(jìn)行，氣壓為7.586 MPa，完成后放置植物培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。

1.2.3激光共聚焦顯微鏡觀察。將基因槍轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)過的幼胚制成橫切片置于載玻片上蓋上蓋玻片后利用ZEISS LSM700，選取405和488 nm 2個(gè)通道進(jìn)行roGFP1觀察和拍攝，隨后加入10 mmol/L H2O2處理5～10 min并拍攝圖像，完畢后吸去H2O2溶液，加入2 mmol/L DTT溶液處理5～10 min再次拍攝圖像。

1.2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米幼胚。用pCAMBIA1304PubiroGFP1Tnos載體轉(zhuǎn)化C58C1農(nóng)桿菌獲得轉(zhuǎn)化菌株；用該轉(zhuǎn)化菌株菌液浸染綜31野生型玉米幼胚，經(jīng)過共培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入到含潮霉素B（Hygromycin B）的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，將誘導(dǎo)分化的玉米幼苗移栽至大棚繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5PCR 和Southern Blot鑒定轉(zhuǎn)基因植株。PCR鑒定所用引物為FWhyg和RV35S（表1），條件為變性溫度95 ℃，45 s，退火溫度60 ℃，40 s，延伸溫度72 ℃，1 min，30個(gè)循環(huán)，陽(yáng)性植株P(guān)CR產(chǎn)物應(yīng)出現(xiàn)大小為542 bp，然后熒光觀察玉米葉片。結(jié)合兩者的初步鑒定，將篩選出的玉米材料做Southern Blot鑒定，大致過程如下：利用roGFPF和roGFPR（表1）擴(kuò)增出roGFP1基因特異的探針；用CTAB法大量提取玉米基因組DNA，Hind III 酶切40 V電泳過夜后將凝膠進(jìn)行酸堿變性，利用毛細(xì)管堿性轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜18 h，將膜80 ℃烤箱烘烤2 h后進(jìn)行預(yù)雜交，2 h后用同位素標(biāo)記的roGFP1探針進(jìn)行雜交試驗(yàn)，18 h后洗膜和壓片。

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析。利用ImageJ軟件對(duì)圖片進(jìn)行處理，熒光強(qiáng)度比值計(jì)算過程如前所述[8]。

2結(jié)果與分析

2.1RoGFP1探針響應(yīng)H2O2和DTT引起的玉米幼胚氧化還原狀態(tài)改變?yōu)榱颂骄縭oGFP1探針是否響應(yīng)玉米體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變，試驗(yàn)利用基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在玉米幼胚中瞬時(shí)表達(dá)roGFP1基因，通過激光共聚焦顯微鏡觀察不同氧化還原處理下幼胚中的405和488 nm熒光強(qiáng)度并計(jì)算比值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，roGFP1基因能在玉米幼胚中成功表達(dá)；向幼胚切片中先后加入10 mmol/L H2O2溶液roGFP1探針迅速被氧化，熒光強(qiáng)度比值從0.844升高至1.837，而再加入2 mmol、L DTT溶液后roGFP1探針又被還原，熒光強(qiáng)度比值下降至0.911（圖2）。這表明roGFP1基因能夠在玉米幼胚中成功表達(dá)，并且對(duì)幼胚細(xì)胞內(nèi)的可逆性氧化還原狀態(tài)改變作出響應(yīng)。

注：（A）為未處理的玉米幼胚；比值的顏色代表roGFP1的氧化還原狀態(tài)，藍(lán)色表示roGFP1的完全還原狀態(tài)，黃色表示roGFP1的完全氧化狀態(tài)；（B）為經(jīng)10 mmol/LH2O2溶液處理的幼胚；（C）為經(jīng)2 mmol/LDTT溶液處理的幼胚；Scale bar=300 pixel。

roGFP探針在眾多植物細(xì)胞中的研究備受關(guān)注，然而在玉米中還缺乏研究。試驗(yàn)首先通過在Hi II植株授粉后20 d的玉米幼胚中瞬時(shí)表達(dá)roGFP1基因試驗(yàn)證實(shí)，roGFP1能夠在玉米中響應(yīng)H2O2和DTT引起的可逆性氧化還原狀態(tài)改變，這與Meyer[8]利用roGFP2探針在擬南芥根中的研究結(jié)果相吻合。試驗(yàn)隨后利用農(nóng)桿菌浸染綜31玉米幼胚，誘導(dǎo)分化的玉米幼苗經(jīng)熒光顯微鏡觀察和Southern Blot鑒定后存在陽(yáng)性植株，表明roGFP1基因已經(jīng)整合到玉米基因組中。