動(dòng)物源性食品中美托洛爾和拉貝特羅殘留量的測定方法研究

劉思潔 劉曉杰 張博 李青 石矛

【摘 要】目的：建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對動(dòng)物源性食品中美托洛爾和拉貝特羅殘留量的檢測方法。方法：以乙腈和含有0.1%甲酸的水為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為0.3ml/min，柱溫45 C，源溫度： 110?C，毛細(xì)管電壓：3.8 kV，在此色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)行檢測。結(jié)果：該方法的美托洛爾和拉貝特羅最低定量限為0.4μg/ Kg和0.3μg/ Kg；線性范圍為0.1-20.0μg/ Kg， 加標(biāo)回收率分別為95.2%和80.3%。結(jié)論：該方法操作簡便，準(zhǔn)確，快速，提高了樣品檢出靈敏度，能夠同時(shí)檢測美托洛爾和拉貝特羅的殘留量。

【關(guān)鍵詞】美托洛爾；拉貝特羅；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀；動(dòng)物源性食品

【文章編號】1004-7484（2014）02-0428-02

β-受體阻斷劑是用來治療高血壓等心血管疾病的藥物，但是一些不法商販將其作為鎮(zhèn)靜劑濫用于動(dòng)物運(yùn)輸過程中，防治由于動(dòng)物應(yīng)激而造成的突然死亡，最常用的β-受體阻斷劑是美托洛爾和拉貝特羅。 由于該類化合物大多數(shù)是在動(dòng)物屠宰前使用的，因此該類化合物相對其他的獸醫(yī)用藥可能對消費(fèi)者造成的健康風(fēng)險(xiǎn)更大[1]，過量濫用該類藥物或食用高殘留的動(dòng)物源性食品均會影響人體健康。隨著β-受體阻斷劑的濫用，其殘留引起的影響也引起了廣泛的關(guān)注，在動(dòng)物飼養(yǎng)過程中β-阻斷劑類藥物的使用也都有明確的規(guī)定[2]。目前β-受體阻斷劑測定的樣品大多數(shù)為環(huán)境樣本和尿樣，因此建立動(dòng)物源性食品中美托洛爾和拉貝特羅定性定量檢測技術(shù)勢在必行。

近年來，LC/MS正迅速地成為測定β-受體阻斷劑的有效的定性和定量手段[3-4]。本文建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測β-受體阻斷劑美托洛爾和拉貝特羅是針對我國食品安全中最為突出的問題和檢測常見的污染物所急需的檢測方法，解決了食品安全的關(guān)鍵技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；離心機(jī)；氮吹儀；固相萃取（SPE）小柱（6ml，200mg）。

1.2 試劑 甲醇（色譜純）；乙酸乙酯（優(yōu)級純）；乙腈（色譜純）；甲酸（純度為99%，），濃高氯酸（優(yōu)級純）；氫氧化鈉（優(yōu)級純）；β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶（116400unit/mL）；濃氨水（優(yōu)級純）；水為GB /T 6682 規(guī)定的一級水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：美托洛爾（metaprolol）、拉貝特羅 （labetalol），純度均大于95%。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制 分別稱取美托洛爾和拉貝特羅10.0mg置于10ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，于4℃條件下保存。根據(jù)需要吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用基質(zhì)溶液稀釋配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5 樣品前處理

樣品經(jīng)絞碎混合均勻后，準(zhǔn)確稱取5.0g，置于50mL離心管中，加入0.2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH=5.2）10mL，加入50μL的β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，60℃水解3小時(shí)，超聲提取10min后10000r/min 離心10min。沉淀再用10mL 1.0mol/L高氯酸溶液提取一次，合并兩次提取液。用1mol/L的NaOH調(diào)pH=4.0，以10000r/min冷凍離心，上清液待凈化。

MCX柱依次用6ml甲醇、6ml水活化后，加入上述溶液過柱，棄去過濾液。依次用6ml的0.1mol/L醋酸、6mL甲醇淋洗，棄去過濾液和淋洗液，再用6mL的5%醋酸乙酯一氨水溶液洗脫，收集洗脫液于玻璃小瓶中，氮?dú)獯蹈桑?mL0.1%甲酸水定容，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，UPLC-MS/MS測定。

1.6 色譜質(zhì)譜條件

1.6.1 超高效液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH Shield RP 18 柱（100 mm×2.1 mm i.d.， 1.7μm），柱溫：45℃，進(jìn)樣體積：2μl；流動(dòng)相A為含0.1%的甲酸水，流動(dòng)相B為乙腈，流速為0.3ml/min。線性流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.1.1 酶解和酸解

β-受體阻斷劑在組織中往往與其他成分形成結(jié)合物，如與葡萄糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相結(jié)合，所以樣品提取時(shí)需用酸或酶水解。對于固體組織樣品，蛋白水解酶消化法能有效釋放與細(xì)胞成分結(jié)合的β-受體阻斷劑和改善提取效率，因此本方法選擇用β一鹽酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酯酶進(jìn)行水解。由于β一鹽酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酯酶在pH 5.2時(shí)的活性最佳，所以本方法采用在pH 5.2的醋酸銨緩沖液中進(jìn)行。

2.1.2 固相萃取柱的選擇

SPE是對β-受體阻斷劑最有效的凈化方法，對美托洛爾和拉貝特羅均有良好的適用性。由于在pH 5.2時(shí)，美托洛爾和拉貝特羅為解離形式，本方法選擇陽離子交換柱，將樣品加至活化后的SPE柱上，用醋酸溶液和甲醇依次淋洗后，用氨甲醇溶液使美托洛爾和拉貝特羅呈非解離態(tài)后洗脫。本方法比較了C柱、MCX柱、C 柱和MCX柱串聯(lián)和PCX柱。C柱和MCX柱串聯(lián)與單獨(dú)用MCX柱無明顯差異；MCX柱比PCX柱有更好的效果。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣， 對美托洛爾和拉貝特羅的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化， 在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行了全掃描， 結(jié)果表明：在正離子模式下，美托洛爾和拉貝特羅全掃描的分子離子[M+H]+最理想。同時(shí)分別對1.0μg/mL的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分子離子全掃描，然后以分子離子為母離子（分別為268.3和329.2），對其子離子進(jìn)行全掃描（分別為116.1和311.3），并優(yōu)化得到美托洛爾和拉貝特羅的母離子和子離子所需的最佳錐孔電壓為35 V和28 V，碰撞能量為18eV和25eV。最后，以多反應(yīng)監(jiān)測（ MRM） 方式對美托洛爾和拉貝特羅進(jìn)行掃描。美托洛爾和拉貝特羅標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

圖1 美托洛爾（A）和拉貝特羅（B）標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.3 色譜條件的優(yōu)化

由于電噴霧質(zhì)譜的離子化是在溶液狀態(tài)中電離，因此流動(dòng)相的組成和添加劑除了影響目標(biāo)化合物的分離（保留時(shí)間和峰形）外，還會直接影響到目標(biāo)化合物的離子化效率，從而降低目標(biāo)化合物的檢測靈敏度。分別采用甲醇-0.05%甲酸水、乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相考察了不同有機(jī)相組成對離子化的影響，同時(shí)比較了水相中不同甲酸含量（0.1%～0.2%）對靈敏度的影響。實(shí)驗(yàn)表明以乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相的靈敏度明顯高于以甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相的靈敏度。不同水相的結(jié)果比較表明，0.1%的甲酸添加量的靈敏度高于其他濃度，低于 0.1%電離程度不足，而高于 0.1%可能會導(dǎo)致離子抑制效應(yīng)，反而降低了靈敏度，因此，方法選用了乙腈和 0.1 %甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

2.4 線性范圍、檢出限、定量限

美托洛爾和拉貝特羅在 0.1μg/kg-20μg/kg具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于 0.99。以信噪比為3時(shí)的空白樣品基質(zhì)加標(biāo)的含量為方法的檢出限，信噪比為10的空白樣品基質(zhì)加標(biāo)的含量為定量限。美托洛爾和拉貝特羅的檢出限均能達(dá)到0.1μg/kg，最低定量限為 0.4μg/kg和0.3μg/kg。

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在豬肉、牛肉中分別進(jìn)行三個(gè)濃度 0.2，1.0， 5.0 μg/kg，六個(gè)平行的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。美托洛爾和拉貝特羅的加標(biāo)回收率為 95.2%和80.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 7.4%和9.5%。

本研究建立了動(dòng)物源性食品中美托洛爾和拉貝特羅定性定量檢測技術(shù)，用所建立的方法對市場上豬肉、牛肉、羊肉、豬肝、豬腎等動(dòng)物源性樣品進(jìn)行檢測，均取得了滿意的測定結(jié)果。本方法解決了食品安全中β-受體阻斷劑美托洛爾和拉貝特羅檢測的關(guān)鍵技術(shù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳永寧，苗紅、范賽等. 高效液相色譜——線性離子肼質(zhì)譜法測定畜禽肌肉中β2-受體激動(dòng)劑和β-受體阻斷劑類藥物殘留[J]. 中國科學(xué) B輯： 化學(xué)，2009，39（8）：774-784.

[2] 吳永寧， 邵兵， 沈建忠. 獸藥殘留檢測與監(jiān)控技術(shù)-食品安全關(guān)鍵技術(shù)系列圖書. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2007. 615.

[3] 范賽，鄒建宏，苗虹等. 液相色譜-三級質(zhì)譜法分析尿液中β2-受體激動(dòng)劑和β-受體阻斷劑多組分殘留[J].分析化學(xué)，2011，39（8）：1153-1158.

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