1株咪草煙高效降解菌的篩選及鑒定

保永明　劉念　張琪慧　何佳遙　董愛榮

摘要 [目的]篩選對(duì)咪草煙具有降解作用的高效鄉(xiāng)土菌株。[方法]對(duì)采自黑龍江省哈爾濱市郊區(qū)的對(duì)咪草煙具有降解作用的多種菌株進(jìn)行了分離、篩選及鑒定。[結(jié)果]篩選得到3株菌： CX白、CX紅和CX黃，其降解率分別為 58.98%、38.82% 和13.19%，其中降解效果最好的CX白屬于革蘭氏陽性的芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。[結(jié)論]為咪草煙高效降解菌的田間實(shí)際應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。

關(guān)鍵詞 咪草煙；降解菌；高效液相色譜；鑒定

中圖分類號(hào) S482.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）20-06707-02

Screening and Identification of One Efficient Imazethapyrdegrading Bacterium

BAO Yongming，DONG Airong et al

（Northeast Forestry University，Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] The aim was to screen one efficient imazethapyrdegrading bacterium. [Method] Some imazethapyrdegrading bacterium strains which were collected from Harbin suburb of Heilongjiang were isolated， screened and identified. [Result] Three degradation strains were selected， containing CXwhite， CXred and CXyellow. The degradation rates of CXwhite， CXred and CXyellow were 58.98%， 38.82% and 13.19%， respectively. Using the DNAExtracted kit， the DNA of CXwhite were extracted and amplified by PCR. The CXwhite which could degrade imazethapyr efficiently belonged to Bacillus sp. [Conclusion] The research results lay theoretical basis for field application and industrial production of imazethapyrdegrading bacterium.

Key words Imazethapyr；Degrading bacteria；HPLC；Identification

除草劑咪草煙因具殺草譜廣、活性高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國大豆產(chǎn)區(qū)用于雜草防治的重要農(nóng)藥。咪草煙在土壤中半衰期長，自然降解緩慢[1]，隨著使用年限的增加，殘留咪草煙會(huì)污染農(nóng)田土壤，對(duì)后茬敏感作物產(chǎn)生藥害，并導(dǎo)致大豆田輪作困難。此外，殘留咪草煙還可通過雨水滲透，對(duì)農(nóng)田周圍水源造成污染，經(jīng)食物鏈富集，亦可對(duì)人和其他哺乳動(dòng)物的健康構(gòu)成潛在危害[2]。目前全國大豆每年種植面積近700萬hm2，其中黑龍江省大豆種植面積約占全國的60%，因而咪草煙使用量巨大。鑒于此，筆者分離并鑒定了對(duì)咪草煙具有降解作用的高效鄉(xiāng)土菌株，以期填補(bǔ)該領(lǐng)域的空白并為后續(xù)田間實(shí)際應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：硝酸銨1.00 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.50 g，硫酸銨0.50 g，磷酸二氫鉀0.50 g，酵母膏0.05 g，磷酸氫二鉀1.50 g，水1 L，pH 7.0。

富集培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，氯化鈉1.00 g，磷酸氫二鉀1.00 g，水1 L，葡萄糖1.00 g，pH 7.0。

Tonomura無碳培養(yǎng)基：硫酸銨1.00 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.50 g，磷酸氫二鉀1.50 g，硝酸鈉1.00 g，氯化鈣0.05 g，硫酸亞鐵0.02 g，水1 L。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.00 g，蛋白胨10.00 g，瓊脂20.00 g，氯化鈉5.00 g，水1 L，pH 7.0～7.2。

1.1.2 藥劑與試劑。

500 ml 5%咪草煙水劑（豆施樂）；咪草煙原藥（純度99.99%）；DV810A細(xì)菌DNA提取試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；Quick Taq HS DyeMix PCR試劑（廣東廣州美津生物技術(shù)有限公司）；溶菌酶（100 mg/L）Rnase。

1.2 方法

1.2.1 土樣的采集。

采用生物學(xué)統(tǒng)計(jì)法[3]。在黑龍江省哈爾濱市郊區(qū)的大豆和玉米田地進(jìn)行多點(diǎn)隨機(jī)取樣，共采取土樣5份，用無菌聚乙烯膜袋保存樣品，在-4 ℃冰箱保存。

1.2.2 菌株的分離和馴化。

分別稱取待測土樣10.00 g，經(jīng) 105 ℃ 烘干 8 min，置于干燥器中，待冷卻后稱質(zhì)量，計(jì)算土壤含水量。稱取相當(dāng)于 10.00 g 干土的濕土，加入盛有 90 ml富集培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，加咪草煙至100 mg/L，置于 30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。移取培養(yǎng)液10 ml接入90 ml新鮮富集培養(yǎng)基，提高咪草煙至200 mg/L，置于 30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。上述步驟循環(huán)操作[4]，直至咪草煙濃度為500 mg/L。將培養(yǎng)液接入分離培養(yǎng)基（咪草煙濃度為500 mg/L，無碳源），繼續(xù)培養(yǎng)7 d，之后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每隔7 d移種1次，咪草煙濃度仍為500 mg/L，14 d后再將富集所得菌液用平板劃線純化[5]，保存對(duì)咪草煙有降解作用的細(xì)菌。

1.2.3 菌株對(duì)咪草煙降解率的測定。

用接種針挑取初篩出的保存于斜面的各培養(yǎng)菌種，加10 ml無菌水，輕刮斜面制成菌懸液，分別接種到已知除草劑濃度為500 mg/L的30 ml Tonomura無碳培養(yǎng)基中。以不加任何菌株的 Tonomura無碳-咪草煙培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，30 ℃恒溫?fù)u床黑暗振蕩培養(yǎng)3 d后，再靜置培養(yǎng)10 min，得純培養(yǎng)液[6]。

量取純培養(yǎng)液10 ml于無菌離心管中，10 000 r/min離心5 min，取上清液，加入250 ml分液漏斗中，同時(shí)向分液漏斗中加入上清液2倍體積的二氯甲烷，劇烈振蕩10 min，加入氯化鈉至飽和，再劇烈振蕩2 min，室溫下靜置，使有機(jī)相與水相分離，重復(fù)2次，合并有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，收集到250 ml圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35 ℃濃縮近干，然后在常溫下吹干，用色譜甲醇定容至2 ml，待測[7]。

1.2.4 高效液相色譜檢測條件。

色譜柱：250 mm涂有ZORBAX SBC18的不銹鋼柱，內(nèi)徑4.6 mm；檢測波長254 nm；流速0.9 ml/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μl；流動(dòng)相為甲醇的醋酸水溶液，甲醇∶水∶冰乙酸=38∶58∶4（V/V/V），保留時(shí)間約為8.54 min。采用Agilent1100液相色譜儀，配紫外檢測器（VWD，色譜工作站）[8]。

1.2.5 高效降解菌的基因組DNA提取及系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.5.1 基因組DNA提取。采用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒對(duì)高效菌株進(jìn)行DNA提取。

1.2.5.2 瓊脂糖膠電泳。對(duì)提取的DNA進(jìn)行凝膠電泳，以便確定是否成功提取得到DNA以及DNA的純度是否達(dá)到要求[9]。

1.2.5.3 PCR擴(kuò)增。對(duì)目的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以提高純度方便測序。采用Quick Taq HS DyeMix作為PCR試劑，該產(chǎn)品為預(yù)混了DNA polymerase（Taq DNA Polymerase）、PCR反應(yīng)用Buffer、dNTP Mixture的2×預(yù)混PCR試劑。將其分裝到離心管中，加入模板DNA和引物，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系體積為50 μl[10]，引物為細(xì)菌16S通用引物，27f：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT。

電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若產(chǎn)物純度達(dá)標(biāo)，將PCR產(chǎn)物送公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

以500 mg/L的咪草煙濃度馴化14 d后，篩選到3種革蘭氏陽性細(xì)菌菌株： CX白、CX紅、CX黃，在培養(yǎng)基上外觀分別呈現(xiàn)白色、紅色和黃色。

2.2 降解率的測定

由表1可知，菌株CX黃、CX紅、CX白對(duì)甲胺磷的平均降解效率分別達(dá)到 13.19%、38.82%和58.98%，其中CX白效果最好。

2.3 高效降解菌CX白的基因組DNA提取及系統(tǒng)發(fā)育分析 由圖1和圖2可知，MCY1是降解咪草煙的高效菌株CX白，與Bacillus屬的megaterium種最接近，可信度為98%。據(jù)此可初步鑒定，試驗(yàn)組分離得到的咪草煙高效降解菌是革蘭氏陽性的芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）細(xì)菌。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在黑龍江省本土確實(shí)存在能夠降解除草劑咪草煙的高效菌株，因此，在黑龍江省應(yīng)用微生物降解除草劑咪草煙具有一定的可行性，為除草劑降解找到一條可實(shí)踐的新途徑。該菌株進(jìn)入田間實(shí)際應(yīng)用，將會(huì)極大地消除田間殘留農(nóng)藥對(duì)環(huán)境及農(nóng)作物生長的不良影響，在一定程度上提高農(nóng)作物產(chǎn)量，并減小農(nóng)藥殘留對(duì)人畜健康和安全的潛在影響。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉維屏，鄭巍.除草劑咪草煙在土壤上吸附-脫附過程及作用機(jī)理[J].土壤學(xué)報(bào)，1998，35（4）：475-481.

[2] 何麗蓮，李元.農(nóng)田土壤農(nóng)藥污染的綜合治理[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，18（4）： 430-434.

[3] 齊文虎，謝高地，丁賢忠.精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)土壤采樣密度研究——以上海精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)示范基地為例[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，11（1）：48-52.

[4] 沈東升，方程冉，周旭輝.土壤中降解甲磺隆除草劑的微生物的分離與篩選[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2002，20（3）： 186-189.

[5] 向萬勝，吳金水.土壤微生物的分離，提取與純化研究進(jìn)展[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，14（3）： 453-456.

[6] 張浩，王巖.反相高效液相色譜法檢測土壤中的咪草煙[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，2001，20（4）：264-265.

[7] 周艷明，張寒松，趙瑛博，等.反相高效液相色譜法檢測大豆中咪草煙[J].食品科學(xué)，2010（8）：237-240.

[8] 才紹玉.高效液相色譜法測定咪·三氟水劑中咪草煙和三氟羧草醚的含量[J].化學(xué)工程師，2003（4）：31-32.

[9] 趙勇，周志華，李武，等.土壤微生物分子生態(tài)學(xué)研究中總 DNA 的提取[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，24（5）： 854-860.

[10] 張桂山，賈小明，馬曉航，等.一株多菌靈降解細(xì)菌的分離，鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].微生物學(xué)報(bào)，2004，44（4）： 417-421.