分子標記在我國紅豆杉科保護植物中的應用

毛慶家

摘 要： 簡述了我國紅豆杉科保護植物的種類，對幾種DNA分子標記技術在紅豆杉科保護植物中的應用，特別是對紅豆杉屬植物在遺傳多樣性、分類學、性別鑒定、特定性狀的連鎖標記、分子標記的開發等方面進行了詳細闡述，同時指出了今后分子標記應用的重點。

關鍵詞： 紅豆杉科；保護植物；分子標記

中圖分類號：S791.49 文獻標識碼：A 文章編號：1004-3020（2014）04-0023-06

分子標記自問世以來短短幾十年已發展到數10種。廣義的分子標記是指可遺傳的并可檢測的序列或蛋白質，而狹義的分子標記僅指DNA標記。現有的DNA分子標記可分為三類：第一類是通過限制性酶切消化結合Southern雜交技術獲得的標記，如RFLP（限制性片段長度多態性）標記[1]。第二類是通過PCR擴增獲得的標記，如RAPD（隨機擴增多態性DNA）標記[2]。第三類是通過限制性酶消化和PCR擴增相結合所獲得的標記，如AFLP（擴增片段長度多態性）標記[3]。根據擴增產物有無特異性，基于PCR 的分子標記又可分成特異標記和非特異標記2類。常用的非特異標記有RAPD、AFLP、ISSR（簡單序列重復區間擴增） [4]和SRAP（相關序列擴增多態性）[5]，特異標記有SSR（簡單序列重復）[6]等。本文主要闡述了這幾種分子標記在紅豆杉科保護植物中的應用進展。

1 我國紅豆杉科保護植物的種類

紅豆杉科有5個屬，分別是穗花杉屬、榧樹屬、澳洲紅豆杉屬、白豆杉屬和紅豆杉屬。除澳洲紅豆杉屬生長在南半球外，其余均產自北半球，分布于歐亞和美洲大陸的寒溫帶、溫帶和亞熱帶地區。紅豆杉科紅豆杉屬植物為針葉樹類植物，通常認為世界上有9個種，我國共有3 種2 變種，分別是東北紅豆杉Taxus cuspidata、密葉紅豆杉T. fuana、須彌紅豆杉T. wallichiana、紅豆杉T. wallichiana var. chinensis和南方紅豆杉T. wallichiana var. mairei，均為珍稀瀕危保護植物[7]。

紅豆杉屬植物集藥用、材用和觀賞等于一體，尤其是其樹皮、枝葉中含有抗癌特效藥物紫杉醇而非常珍貴。紫杉醇是目前世界上最好的抗癌藥物，具有極高的開發利用價值。為保護紅豆杉屬自然資源免遭滅絕，根據國務院1999年8月4日批準的國家林業局、農業部申報的《國家重點保護野生植物名錄（第一批）》，紅豆杉科國家Ⅰ級保護植物有：臺灣穗花杉Amentotaxus formosana、云南穗花杉A.yunnanensis、紅豆杉屬所有種Taxus spp.；國家Ⅱ級保護植物有：白豆杉Pseudotaxus chienii、榧屬所有種Torreya spp.。

2 常用分子標記在紅豆杉科國家保護植物中的應用2.1 RFLP標記

紅豆杉科在我國有4個屬即紅豆杉屬、白豆杉屬、穗花杉屬和榧樹屬，它們均是研究裸子植物系統發育的重要材料。王艇等[8]通過對rbcL基因進行PCR-RFLP 分析對紅豆杉科的一些基本系統學問題進行了研究，結果表明紅豆杉科是一自然的單系群得到了RFLP標記的有力支持；紅豆杉屬構成了穗花杉屬、白豆杉屬和榧樹屬的姊妹群；穗花杉屬和白豆杉屬宜置于紅豆杉科內處理為屬，不贊同將這兩個屬分別獨立成科的觀點；白豆杉屬同榧樹屬的關系密切。

2.2 RAPD標記

2.2.1 遺傳多樣性研究

張宏意等[9]基于RAPD 分子標記對廣東、湖南和江西12 個南方紅豆杉自然居群的遺傳多樣性進行研究，從100 個引物中共篩選出10個，獲得譜帶86條，多態性位點百分率（PPB）占51.16%，粵北9個居群的遺傳多樣性較低。聚類分析結果表明，不同產地個體間的遺傳距離較大。

蘇建榮[10]采用RAPD技術對須彌紅豆杉遺傳多樣性進行了研究，PPB值高達93.72%，僅低于曼地亞紅豆杉（94.9%）[11]，而高于南方紅豆杉（51.16%）[9]、歐洲紅豆杉（82.92%）[12]、加拿大紅豆杉（20.6%）[11]、歐洲紅豆杉（86.5%）[11]、東北紅豆杉（76.84%）[11]。

茹文明等[13]采用RAPD 技術檢測了山西南部南方紅豆杉8個種群的遺傳多樣性。21個引物共檢測出134個位點，其中多態性位點123個，占91.79%。南方紅豆杉種群內平均遺傳多樣性為1.493，總的遺傳多樣性平均為2.180，在總的遺傳變異中，大部分存在于種群內（68.3%），種群間占31.7%。在南方紅豆杉種群總的遺傳變異中，種群內個體的遺傳變異大于種群間個體的遺傳變異。

鄭超等[14]采用RAPD標記研究了分屬于4 種紅豆杉屬植物的68個單株的遺傳多樣性，南方紅豆杉的多態性條帶百分率最高，達56.0%，而須彌紅豆杉的多態性條帶百分率最低，為43.1%。南方紅豆杉和須彌紅豆杉的遺傳距離最近，為0.289 3，這一研究結果支持在Flora of China[7]中將南方紅豆杉作為是須彌紅豆杉1個變種的分類處理，

2.2.2 遺傳分化研究

王艇等[15]用20個RAPD標記引物對國家二級保護植物白豆杉11 個種群共計91個體的DNA 樣品進行擴增，得到264條譜帶，平均每個引物擴增出13.20條，多態位點百分率為76.14 %。根據白豆杉種群RAPD 數據矩陣計算出的Nei基因分化系數GST值為0.586 5，表明白豆杉種群間發生了極其顯著的遺傳分化。

由于白豆杉種群間已發生高度遺傳分化，所以建議在保育過程中盡量避免在種群之間實施種質遷移，最好不在分化顯著的種群間人為移栽個體。

2.2.3 親緣關系研究

李斌連[16]利用RAPD標記從64個RAPD引物中篩選出有帶的引物9個，檢測出的多態性條帶占總條帶數的比例（PPB）約為27%，說明紅豆杉屬植物之間的遺傳差異不大。通過聚類分析，栽培的密葉紅豆杉和栽培的曼地亞紅豆杉（Taxus ×media）的遺傳上較為相似，與南方紅豆杉親緣關系次之；而南方紅豆杉各變種間親緣關系因取材地域不同也有一定的差異。

2.2.4 分子系統學研究

王艇等[17]采用RAPD技術研究了紅豆杉科植物紅豆杉、南方紅豆杉、白豆杉、穗花杉Amentotaxus argotaenia 、云南穗花杉和云南榧樹Torreya yunnanensis等6種植物，在分子水平上對紅豆杉科植物的系統發育進行了探討。RAPD分析表明， 紅豆杉與南方紅豆杉的遺傳距離較小（0.121）， 從聚類分析的結果可見在種一級的水平上其遺傳分化是非常小的，不支持將紅豆杉再分為兩個獨立種的意見。

王貴榮等[18]利用RAPD進行多態性檢測，參試的6 種紅豆杉的多態性條帶占總條帶數的比例（PPB）約為44.8%，說明供試紅豆杉材料的遺傳基礎較窄，各個種之間的遺傳分化比較小，但它們的染色體數完全一致，2n=24條。該試驗發現南方紅豆杉與中紅豆杉的親緣關系最近， 這與中國植物志[19] 將南方紅豆杉作為紅豆杉的一個變種相一致。

2.2.5 與紫杉醇含量相關的RAPD連鎖標記研究

陳毓亨等[20]最早做了南方紅豆杉紫杉烷含量與RAPD相關性分析研究。在RAPD標記中，紫杉醇高含量樣品具有區別于所在地區其他個體的擴增條帶，如峨眉山有30條，云南有15條，武寧僅4條。云南和峨眉山的2個樣品一定程度上似與它們的形態差別有一定的聯系。而武寧2個樣品的形態和生態與所在地區其他樣品沒有區別，但在DNA條帶上有一定差異。因此，這些條帶已在一定程度上排除了形態和生態的影響。21個引物中，有9個引物出現僅見于兩個地區間（如四川與云南或云南與江西）高含量紫杉烷樣品的共同的特征性條帶。RAPD擴增結果的UPGMA 聚類分析也表明，這7個樣品都分別與所在地區內其他個體有一定的遺傳距離，說明這些高含量樣品都不同程度地從地區中分化出來，各自形成自己的分子特征。就上述初步研究而言，在南方紅豆杉中至少存在3個高含量紫杉烷植株系。

蘇建榮等[21]對所有采樣的須彌紅豆杉植株開展了RAPD標記與不同器官紫杉醇含量的關聯研究。篩選出了指示樹皮、小枝、針葉紫杉醇低含量的RAPD 特異性條帶分別為4 條、2 條和5 條；指示樹皮和針葉紫杉醇次低含量的特異性條帶各1條。利用它們可縮小高含量紫杉醇植株的篩選范圍，減少篩選成本和工作量，具有一定的生產意義。而與陳毓亨等[20]的南方紅豆杉研究結果不同，須彌紅豆杉未篩選出指示紫杉醇高含量的特異性RAPD標記。

2.3 AFLP標記

2.3.1 遺傳多樣性和遺傳分化研究

江建銘等[22]應用AFLP標記方法對（南方）紅豆杉種質資源遺傳多樣性研究，從32對引物組合中篩選了10對引物組合，共擴增出多態性位點107個，多態性位點占總擴增位點的比例平均為78.1%。

同年，于曉芹等[23]應用AFLP標記方法，得出不同居群的多態位點比例從27.32%～41.53%（PPB）。AMOVA分析結果表明：須彌紅豆杉居群間的變異是居群內變異的2倍（各居群間變異占66.70%，居群內變異占33.30%），表明須彌紅豆杉居群變異成分主要發生在居群間；各居群間的遺傳分化系數Fst為0.67，表明居群間的遺傳分化極顯著。PopGene所得基因分化系數Gst為0.554 5 （低于Fst值）同樣表明居群間的遺傳分化極顯著。

2.3.2 性別鑒定研究

肖璐等[24]利用AFLP技術，從64對引物組合中篩選出了7對引物組合，在雌雄基因池中表現出差異，共擴增出11條差異性條帶，其中在雄株中只擴增出1條差異性條帶，在雌株上擴增出10條差異性條帶，但這11個與性別相關的AFLP標記，其DNA序列能否作為候選有價值的性別鑒定探針或發展為PCR引物，還需進一步深入研究。

2.4 ISSR標記

ISSR標記在南方紅豆杉中的應用僅限于其遺傳多樣性和遺傳分化的研究。

張蕊等[25 ]利用8個ISSR引物對15個種源的南方紅豆杉進行PCR擴增，共檢測到90個位點，其中89個位點呈現多態性，多態性位點百分率為98.89%，說明其在物種水平上的遺傳多樣性豐富。南方紅豆杉種源遺傳多樣性受其產地經度和緯度非線性共同影響，偏南和偏西地區種源的遺傳多樣性較低，偏東和偏北地區種源遺傳多樣性則較高。因試驗的南方紅豆杉種源其原產地種群皆是較大的古樹群， 片斷化的時間較短， 加上其特有的繁育特性， 種源間基因分化系數為0.121 1，僅有8.75%的遺傳變異存在于種源間，而91.25%的遺傳變異來自于種源內。

李乃偉等[26]采用ISSR 標記技術對南方紅豆杉遷地保護小種群及其衍生自然種群5個小斑塊（小居群） 的遺傳多樣性行了分析。從90條引物中共篩選出10 個多態性引物，獲得ISSR 譜帶102條，其中多態性譜帶74條，占72.54%。聚類分析結果表明：南方紅豆杉遷地保護各自然小居群間的遺傳距離與這些居群的地理生境有關， 而與地理距離并沒有顯著相關性。其主要原因是各小居群為衍生自然居群內部的分區， 雖呈斑塊分布但未形成嚴格的區域隔離，可以視為一個居群整體，從而與針對具有嚴格區域隔離的大范圍的植物居群的分析結果有所不同。

李乃偉等[27]采用ISSR 標記方法，對南方紅豆杉3個野生種群、2個遷地保護栽培種群及2個遷地保護衍生種群的遺傳多樣性進行了分析和比較。合并后的遷地保護衍生種群以及野生種群均有較高的遺傳多樣性，二者的PPB值相近，分別為78.08%和82.19%。這表明在植物園次生林環境條件下，回歸到自然生境下的南方紅豆杉遷地保護衍生種群的遺傳多樣性趨于豐富并接近野生種群，從而證明了植物園在瀕危植物遷地保護中具有以往未被認識到的巨大潛力。為使植物園保護的植物小種群能夠長久繁衍，在建立一個新的植物園之初，就應考慮供游人參觀的開放區與供植物種群繁衍擴張的自然區的結合。

丁桂生[28]利用ISSR分子標記對來自10省區15個南方紅豆杉種源共300株個體進行PCR擴增，共檢測到90個位點， 其中89個位點呈現多態性，多態性位點百分率為98.89%，表明南方紅豆杉物種水平上的遺傳多樣性豐富。AMOVA分析結果顯示，南方紅豆杉種源間的遺傳變異較小，僅占總變異的8.75%，這是因為南方紅豆杉為風媒異花授粉樹種，傳粉能力強，其種子具有紅色帶甜味的肉質假種皮，可借助鳥及鼠類的吞食而得以遠距離傳播，原有種群間的基因交流頻繁，加之現有保留種群片斷化的時間較短，未發生嚴重的遺傳分化。

2.5 SRAP標記

任娜[29]首先利用傳統的形態學鑒定方法對20株來自南方紅豆杉和須彌紅豆杉的供試菌株進行形態學鑒定，結果顯示：20株供試菌株被分為4類。

為了篩選出更優良的紫杉醇產生菌，采用了相關序列擴增多態性（SRAP）分子標記技術對20株紅豆杉內生真菌菌株進行遺傳多樣性分析。結果顯示：24對SRAP引物共擴增出584條帶，其中多態性條帶446條，多態性比率為76.4%。

在以相似系數0.601為閾值時，SRAP標記可將20株菌株分為4類，與傳統的形態學分類相比較，SRAP技術能將20株真菌更準確的區分開來。

2.6 RAPD和ISSR標記的聯合應用

張玲玲[30]運用RAPD標記對23個種源的南方紅豆杉遺傳多樣性進行研究，篩選出的13個引物擴增出147條清晰帶，其中多態性帶136條，多態性條帶比率為92.52%，表明南方紅豆杉具有較高的遺傳多樣性。

ISSR標記使用12條引物對23個種源的南方紅豆杉進行遺傳多樣性分析，共擴增145條清晰帶，其中多態性帶140條，96.55%的多態性條帶比率高于目前已報道的其它作物。遺傳相似性分析發現南方紅豆杉種源遺傳多樣性較為豐富。

2.7 SSR標記的開發研究

吳瓊[31]在東北紅豆杉針葉454測序結果中，發現了753個簡單重復序列（SSR）模體，大約85%的SSR模體長度在14～24 bp之間，SSR模體的分布密度為平均12.47 kb編碼區有一個簡單重復序列，頻率為3.1%。六核苷酸有260種，約占34.5%，是最豐富的模體。其次為三核苷酸，有242種，約占32.1%，可見六核苷酸和三核苷酸構成了總的微衛星標記的一多半。

易官美等[32]利用基因組勘測序列（GSS序列）探討開發南方紅豆杉SSR標記的可行性。從1923條GSS序列中搜尋到184個SSR位點。其中二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重復所占比例分別為88.6%、10.3%和1.1%。根據所獲得的184個SSR位點設計引物，最終獲得90個候選SSR引物，并用南方紅豆杉進行PCR 驗證，結果所有的引物都能獲得穩定清晰的條帶。驗證結果表明，所開發的SSR 標記在基因組中的擴增結果多表現為清晰可讀的單一主帶，表明這些標記在基因組中的位置是特異的，能夠有效地反映基因組的多態性，可以成為種子種苗鑒定及分子生物學等相關研究的有力工具。同時該研究結果也表明GSS數據可以有效地用于SSR標記的挖掘，為那些不具備全基因組數據的物種開發分子標記提供了新途徑。

李炎林等[33]利用Trinity軟件對NCBI公共數據庫中南方紅豆杉根、莖、葉的轉錄數據進行了轉錄組的重新拼接。通過SSR檢測程序從96 279條Unigenes中得到2 160個SSR位點（2.24%），其平均發生率為1/18.01 kb，基序長度為14～25 bp之間。優勢重復基序為六核苷酸和三核苷酸，分別占總SSR 位點的38.56%和37.08%。2 160個SSR 位點由703 種重復基序構成，其中六核苷酸占60.96%，二、三核苷酸占總SSR 位點的44.81%。隨機挑選62 對SSR引物對8個南方紅豆杉株系進行了SSR擴增，有效擴增率為53.23%，多態性比率為38.71%。

3 展望

SRAP是一種新型的基于PCR的非特異標記標記技術，與其它分子標記技術相比較，具有產率高、多態性高、共顯性高、重復性好，在基因組中分布均勻，較易測序，便于克隆目標片段，操作簡單，引物具有通用性，且其正、反引物兩兩搭配組合，提高了引物的使用率，降低成本。因此，SRAP也可用于紅豆杉屬植物的遺傳多樣性研究等。

在紅豆杉科保護植物中所用到的分子標記大都局限于RAPD和ISSR等，其穩定性和重現性一直備受質疑。特異性分子標記具有重現性好，擴增靶序列在基因組中位置確定等優點，因而倍受研究者青睞。最常用的特異標記是SSR。近年來，許多植物中都開展了表達序列標簽（EST）的測序工作，互聯網上有關數據庫中積累了大量的EST序列數據。從這些數據中可以發現，在EST序列中也存在SSR位點。因此，人們試圖利用EST序列開發SSR標記，稱為EST-SSR標記。

基因組勘測序列是基因組DNA克隆的一次性部分測序得到的序列，目前互聯網上已登錄了一些的南方紅豆杉GSS 序列。GSS序列是NCBI的一部分，已經整合到了GenBank中，與EST數據庫類似。區別在于GSS序列是從全基因組序列克隆兩端獲得的短的部分序列，而不是從cDNA 文庫中獲得的克隆，因此GSS 數據更能反映所研究生物全基因組的特征。這些多態性轉錄組SSR引物的開發將為紅豆杉遺傳多樣性的分析、遺傳圖譜構建和功能基因的挖掘提供更豐富的標記。

參 考 文 獻

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（責任編輯：鄭京津）