真空包裝冷藏鱘魚中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離、鑒定及生長預(yù)測

焦維楨

摘 要：為監(jiān)測真空包裝鱘魚在冷藏過程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌動(dòng)態(tài)變化，通過感官評(píng)價(jià)和傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)的方法，對(duì)真空包裝冷藏鱘魚中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行了分析；同時(shí)選擇性分離篩選出代表性菌株Q-1和C-1，并基于16S rRNA基因進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明：氣單胞菌和腸科菌是真空包裝鱘魚在冷藏過程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌；菌株Q-1可能為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）新亞種，菌株C-1為路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）；同時(shí)與菌株C-1相比，菌株Q-1的生長延滯期較長，但生長較快，修正的Gompertz模型能夠可靠地分別預(yù)測菌株C-1和菌株Q-1在真空包裝鱘魚在冷藏過程中生長動(dòng)態(tài)。

關(guān)鍵詞：鱘魚；優(yōu)勢(shì)腐敗菌；分離；鑒定；生長預(yù)測

Abstract： The objective of this study was to isolate and identify dominant spoilage bacteria in cold-stored sturgeon under vacuum condition， as well as make predictions of the bacteria growth. Sensory evaluation and selective culture were used to monitor the kinetic growth of dominant spoilage bacteria. Based on 16S rRNA gene sequencing， Q-1 and C-1 were identified and isolated selectively as dominant spoilage bacteria. The results showed that Aeromonas sp. and Enterobacter sp. were dominant spoilage bacteria in cold-stored sturgeon under vacuum condition. Q-1 was likely to be a new subspecies of Aeromonas veronii， and C-1 was Enterobacter ludwigii. Compared with C-1， the lag phase of Q-1 was longer and the growth rate was higher. A modified Gompertz equation could make a credible prediction of the dynamic growth of C-1 and Q-1 in the cold-stored sturgeon under vacuum condition.

Key words： sturgeon； dominant spoilage bacteria； isolation； identification； growth prediction

中圖分類號(hào)：TS254.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2014）06-0018-04

鱘魚是世界上一種最古老的亞冷水性淡水魚類，有“水中熊貓”之稱[1]。我國鱘魚商業(yè)化養(yǎng)殖起步于20世紀(jì)90年代初，隨著鱘魚人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)的不斷發(fā)展與推廣，目前已是鱘魚養(yǎng)殖的世界第一大國[2-3]。成熟的鱘魚一般個(gè)體較大，因此除用于生產(chǎn)魚子醬、軟骨等產(chǎn)品外，鱘魚魚肉也加工成小包裝形式的產(chǎn)品，并直接進(jìn)入超市貨架。

新鮮魚肉營養(yǎng)豐富，容易腐敗，其中微生物是影響魚肉腐敗的最重要因素之一[4]。不同包裝方式對(duì)魚體微生物分布具有重要影響。大量研究表明，在有氧包裝中，假單胞菌（Pseudomonas sp.）、希瓦氏菌（Shewanella sp.）

和腸桿菌科（Enterobacteriaceae）是魚肉貯藏中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌；而乳酸菌、氣單胞菌（Aeromonas sp.）、熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）等則在真空包裝條件下占據(jù)生長優(yōu)勢(shì)，Photobacterium phosphoreum則常見于氣調(diào)包裝中[5-9]。因此，為預(yù)防魚肉腐敗，延長產(chǎn)品貨架期，有必要對(duì)特定貯藏條件下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行分析并進(jìn)行生長預(yù)測。目前，預(yù)測微生物模型已廣泛應(yīng)用于各類食品的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，例如修正的Gompertz模型、Baranyi模型及Logistic模型等都是都是應(yīng)用較廣泛的微生物生長預(yù)測模型[10-11]。

目前針對(duì)真空包裝鱘魚在冷藏過程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分析較少。本研究采用基于感官評(píng)價(jià)和傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)的方法對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行分析，對(duì)分離篩選得到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行了16S rRNA基因鑒定，并利用修正的Gompertz模型對(duì)其進(jìn)行了生長預(yù)測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鱘魚（質(zhì)量1～1.5 kg，體長40～50 cm） 購自回龍觀海鮮市場；

平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）、氣單胞菌分離瓊脂（ampicillin macconey agar base，AMAB）、乳酸菌分離（deMan rogosa sharpe，MRS）瓊脂、熱殺索絲菌分離（streptomycin thallous acetate actidione，STAA）瓊脂、鐵瓊脂（iron agar，IA） 青島海博生物技術(shù)有限公司；

細(xì)菌基因組總DNA 提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix 北京博邁德科技發(fā)展有限公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DZ-402E型真空包裝機(jī) 浙江溫州真空包裝機(jī)廠；LSB35L-I型立式壓力滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；TGL-20M型醫(yī)用離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；E系列生物顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；KDY-9820凱氏定氮儀 北京通潤機(jī)電技術(shù)公司；

TC-512型PCR儀 英國Techne公司；BG-Power300型電

泳儀 美國Baygene公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將購買的鮮活鱘魚敲擊頭部致死后，去頭、尾、內(nèi)臟，用無菌水清洗瀝干后，無菌條件下取背部白肉分割成的魚片，每片約30 g，無菌真空包裝，4 ℃貯藏，每隔1 d取樣分析。

滅菌鱘魚魚片的制備、接種及貯藏：參照Macé等[12]的方法并適當(dāng)調(diào)整，將鱘魚魚片在無菌環(huán)境下依次用50 g/L Na2CO3溶液、2%（V/V）的福爾馬林溶液清洗，用無菌水充分洗凈后瀝干。經(jīng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)，滅菌魚片的細(xì)菌總數(shù)小于2 lg（CFU/g）。同時(shí)，將分離得到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌菌株分別活化并稀釋至5 lg（CFU/mL）用于魚片接種。滅菌魚片分別浸于5 lg（CFU/mL）不同菌液中，15 s后撈出瀝干，經(jīng)測定魚肉初始接種量為3～4 lg（CFU/g），將接菌后的魚片進(jìn)行無菌真空包裝，4 ℃貯藏，每隔1 d取樣分析。

1.3.2 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)采用質(zhì)量指數(shù)法（quality index method，QIM）[13]。隨機(jī)抽取不同貯藏期的魚肉樣品，對(duì)魚肉的顏色、光澤度、通透性、氣味、表面黏度和質(zhì)地進(jìn)行評(píng)價(jià)。QIM中每個(gè)參數(shù)的分值范圍根據(jù)貯藏期的變化特征在0～3之間，其中0代表最佳的品質(zhì)，分?jǐn)?shù)越高品質(zhì)越差。用每個(gè)參數(shù)分值之和，QI值來代表魚肉感官品質(zhì)。

1.3.3 菌落計(jì)數(shù)

參照GB/T 4789—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測定》方法對(duì)樣品進(jìn)行微生物分析[14]。微生物培養(yǎng)條件如下：采用PCA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d，計(jì)菌落總數(shù)；腸科菌菌數(shù)采用VRBGA培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)2 d計(jì)數(shù)；AMAB培養(yǎng)基用于氣單胞菌計(jì)數(shù)，并于30 ℃ 培養(yǎng)2 d；采用MRS培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)2 d，計(jì)乳酸菌數(shù)；熱殺索絲菌菌數(shù)采用STAA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)2 d計(jì)數(shù)。

1.3.4 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離、鑒定

對(duì)腐敗魚肉中的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，在可計(jì)數(shù)的最高稀釋度平板，隨機(jī)挑取形態(tài)不同的典型菌落，反復(fù)在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上劃線，革蘭氏染色、鏡檢，直至得到純菌落。并對(duì)分離的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

16S rRNA基因鑒定：采用16S rRNA基因通用引物，27f：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1495r：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，模板0.5 μL，ddH2O 11 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；94 ℃變性1 min、42 ℃退火30 s、72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。對(duì)所得PCR產(chǎn)物送至北京博邁德科技發(fā)展公司測序，將結(jié)果與NCBI中收錄的其他菌株序列進(jìn)行比對(duì)分析，并運(yùn)用MEGA5.1軟件，采用Neighor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長預(yù)測模型的建立

3 結(jié) 論

真空包裝鱘魚于4 ℃貯藏過程中的貨架期6d，優(yōu)勢(shì)腐敗菌為氣單胞菌和腸科菌。對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行傳統(tǒng)選擇性分離，并對(duì)將兩株代表性菌株分別鑒定為氣單胞菌Q-1和路德維希腸桿菌C-1。同時(shí)，修正的Gompertz模型能夠可靠地預(yù)測氣單胞菌Q-1和路德維希腸桿菌C-1在鱘魚魚肉中生長動(dòng)態(tài)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫大江， 馬國軍， 吳文化. 我國鱘魚子醬產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)[J]. 中國水產(chǎn)， 2011（7）： 25-27.

[2] 孫大江， 曲秋芝， 張穎， 等. 中國的鱘魚養(yǎng)殖[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志， 2011， 24（4）： 67-70.

[3] WEI Qiwei， ZOU Yuanchao， LI P， et al. Sturgeon aquaculture in China： progress， strategies and prospects assessed on the basis of nationwide surveys （2007–2009）[J]. Journal of Applied Ichthyology， 2011， 27（2）： 162-168.

[4] GRAM L， HUSS H H. Microbiological spoilage of fish and fish products[J]. International Journal of Food Microbiology， 1996， 33（1）：121-137.

[5] HOVDA M B， SIVERTSVIK M， TORE LUNESTAD B， et al. Characterisation of the dominant bacterial population in modified atmosphere packaged farmed halibut （Hippoglossus hippoglossus） based on 16S rDNA-DGGE[J]. Food Microbiology， 2007， 24（4）：362-371.

[6] 藍(lán)蔚青， 謝晶. 冷藏帶魚貯藏期間主要微生物動(dòng)態(tài)變化的PCR-DGGE分析[J]. 食品工業(yè)科技， 2012， 33（17）： 118-122.

[7] 孟曉華， 段杉. 生鮮羅非魚片在冷藏過程中細(xì)菌群落演替的PCR-DGGE分析[J]. 食品工業(yè)科技， 2012， 33（11）： 343-347； 351.

[8] 勵(lì)建榮， 劉永吉， 朱軍莉， 等. 真空、空氣和氣調(diào)包裝對(duì)冷藏魚糜制品品質(zhì)的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2011， 35（3）： 446-455.

[9] COTON M， JOFFRAUD J J， MEKHTICHE L， et al. Biodiversity and dynamics of the bacterial community of packaged king scallop （Pecten maximus） meat during cold storage[J]. Food microbiology， 2013， 35（2）： 99-107.

[10] 郭全友， 楊憲時(shí). 冷藏大黃魚不同細(xì)菌生長模型的比較[J]. 南方水產(chǎn)， 2005， 1（5）： 48-53.

[11] 遲海， 李學(xué)英， 楊憲時(shí). 微生物預(yù)測模型技術(shù)研究進(jìn)展及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2013， 29（3）： 678-682.

[12] MAC? S， CORNET J， CHEVALIER F， et al. Characterisation of the spoilage microbiota in raw salmon （Salmo salar） steaks stored under vacuum or modified atmosphere packaging combining conventional methods and PCR-TTGE[J]. Food Microbiology， 2012， 30（1）： 164-172.

[13] 朱志偉， 李汴生， 阮征， 等. 脆肉鯇魚片冷藏貨架期的QIM及理化方法評(píng)價(jià)的比較研究[J]. 水產(chǎn)科技， 2010（4）： 11-16.

[14] 國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局. GB 4789.2-2010 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2010.

[15] ZWIETERING M， JONGENBURGER I， ROMBOUTS F， et al. Modeling of the bacterial growth curve[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1990， 56（6）： 1875-1881.

[16] CHANG K L B， CHANG J， SHIAU C Y， et al. Biochemical， microbiological， and sensory changes of sea bass （Lateolabrax japonicus） under partial freezing and refrigerated storage[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1998， 46（2）： 682-686.

[17] GUI Meng， SONG Juyi， ZHANG Zhichao， et al. Biogenic amines formation， nucleotide degradation and TVBN accumulation of vacuum-packed minced sturgeon （Acipenser schrencki） stored at 4℃ and their relation to microbiological attributes[J]. Jouvrnal of the Science of Food and Agriculture， 2014.

[18] DOULGERAKI A I， ERCOLINI D， VILLANI F， et al. Spoilage microbiota associated to the storage of raw meat in different conditions[J]. International Journal of Food Microbiology， 2012， 157（2）： 130-141.

[19] 張曉君， 房海， 陳翠珍， 等. 殺鮭氣單胞菌一新亞種的生物學(xué)特性及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)， 2006， 13（6）： 917-923.

[20] 李琳， 潘子強(qiáng). 水產(chǎn)品特定腐敗菌的確定及生長模型建立研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā)， 2011， 32（6）： 152-156.

[21] 董慶利， 曾靜， 熊成， 等. 不同貯藏溫度下冷卻豬肉貨架期預(yù)測模型的構(gòu)建[J]. 食品科學(xué)， 2012， 33（20）： 304-308.