DMDC處理對桑果汁品質的影響

程銀棋等

摘 要 在桑果汁中添加250 mg/L DMDC，檢測其在4 ℃貯藏期間污染菌和營養品質的變化。結果表明，新鮮桑果汁中添加250 mg/L DMDC后，果汁中的菌落總數、乳酸菌數、酵母菌數以及霉菌數均呈線性快速下降，在添加DMDC 12 h后，各種菌群的數量不再顯著減少（p>0.05）。添加250 mg/L DMDC的桑果汁在4 ℃下貯藏時間能延長至30 d左右，并且在30 d貯藏期內，桑果汁的色差、pH、總滴定酸和可溶性固形物含量沒有發生顯著變化，而桑果汁中的2種花色苷含量（蕓香苷和矢車菊素）、總酚含量、DPPH自由基清除力和α-葡萄糖苷酶抑制率則出現明顯波動。

關鍵詞 二甲基二碳酸鹽（DMDC）；桑果汁；殺菌；品質

中圖分類號 S663.9 文獻標識碼 A

Abstract Dimethyl Dicarbonate（DMDC）， as an antibacterial（ISN 242）， was approved to use in the fruit juice by the food additives standards of China. In this paper， changes in the microorganisms and quality attributes of mulberry juice during storage at 4 ℃ was investigated as added with 250 mg/L of DMDC. Results found that the counts of total bacteria， lactic acid bacteria， molds and yeasts significantly declined as DMDC was added to mulberry juice， and no further reductions of microbial counts were observed after 12 h of adding DMDC. And the counts of total bacteria， lactic acid bacteria， molds and yeasts significantly declined as DMDC was added to mulberry juice， and no further reductions of microbial counts were observed after 12 h. The storage times of mulberry juice added with 250 mg/L of DMDC can extend to about 30 d during storage at 4 ℃. Moreover， all the value of color， pH， titration acid， and total soluble solid showed no significant changes during 30 d storage at 4 ℃ as added with 250 mg/L of DMDC， and the content of anthocyanidin and total phenols， DPPH radical scavenging activity and α-glucosidase inhibitory activity showed a significant fluctuation.

Key words Dimethyl dicarbonate； Mulberry juice； Inactivation； Quality

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.032

桑果屬漿果類水果，其在果實的成熟期特別容易受到微生物污染，鮮榨桑果汁中含有大量的腐敗微生物[1]。對于偏遠地區的果農而言，在沒有熱巴氏殺菌設備和冷藏的條件下，桑果汁在長途運輸過程中很容易發生腐敗變質。此外，由于桑果汁成熟期比較集中，使得小規模果汁加工企業難以有足夠的熱巴氏殺菌設備來處理大批量桑果汁，而新鮮桑果汁即使在低溫冷藏條件下，其微生物貨架期一般也不超過3～5 d。因此，一些安全、方便、高效的防腐劑越來越受到果汁加工企業的青睞[2]。

二甲基二碳酸鹽（Dimethyl dicarbonate，DMDC），又名維果靈，是中國食品添加劑使用標準中允許使用（最大添加量250 mg/L）的果汁飲料防腐劑（INS號242），其防腐作用為殺滅果汁飲料中的微生物，對微生物的致死作用跟菌體內關鍵酶蛋白被DMDC修飾失活密切相關[3-4]。在常溫甚至低溫下，DMDC對果汁飲料中的很多污染菌（特別是酵母菌）具有較強的殺滅能力。研究發現，DMDC添加到果汁飲料中后，能迅速與果汁中微生物菌體的酶蛋白發生反應，并且DMDC在水中也能自發水解，自身在果酒或果汁飲料中無任何殘留，并且也沒有發現其它對動物或人體有害的物質生成，沒有任何異味物質生成，是一種很有潛力的果汁飲料非熱殺菌技術[5]。Fisher 等研究了不同溫度下DMDC對蘋果汁中大腸桿菌的殺菌效果，結果發現，蘋果汁經250 mg/L 的DMDC在4 ℃處理3 d后，能使大腸桿菌降低3.1個對數單位，在10 ℃處理9 d后，能降低3.8個對數單位，在25 ℃處理3 d后不能檢出大腸桿菌[6]。Basaran-Akgul 等[7]也發現蘋果汁添加250 mg/L 的DMDC在室溫下處理6 h后能使大腸桿菌下降5個對數單位以上。目前，尚未見關于DMDC處理對新鮮桑果汁中污染菌和營養品質方面的報道，因此，本文主要研究DMDC處理對桑果汁的殺菌效果及其品質影響，并進一步分析DMDC處理后，桑果汁在低溫貯藏期間殘留菌和營養品質的變化，以期為DMDC在桑果汁保藏中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 完全成熟的桑果采摘自廣東省寶桑園食品有限公司桑果種植基地。

1.1.2 試劑 二甲基二碳酸鹽購自德國朗盛公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購于西安沃爾森生物技術有限公司；Trolox購于阿拉丁試劑有限公司；福林酚試劑由國藥集團化學試劑有限公司生產；PCA瓊脂、孟加拉紅瓊脂和MRS瓊脂購自廣東環凱微生物科技有限公司；其它化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要設備 WF-A2000打漿機，美的有限公司；PB-10型PH計，德國Sartorius公司；SPX-250B-Z型生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-2FD型無菌操作臺，蘇凈集團蘇州安康空氣技術有限公司；Biofuge Stratos Sorvall型臺式高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；UV1800型紫外分光光度計，日本島津公司；YXQ-LS-5OS型立式蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；阿貝折光儀，英國Stanley公司；UltraScan VIS型全自動色差儀，美國HunterLab公司；Agilent-1200高效液相色譜，美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 桑果汁制備 新鮮桑果采用打漿機處理后，過100目濾布，獲得的桑果汁置于4 ℃冰箱中冷藏待用。

1.2.2 DMDC殺菌處理 將1 L新鮮桑果汁（4 ℃）置于無菌操作臺上，加入250 mg/L DMDC并用玻璃棒猛烈地攪拌1 min。然后快速分裝于50 mL滅菌的帶蓋PET塑料瓶中，將其置于4 ℃冰箱內冷藏。每隔一段時間進行間隙取樣，并立即進行微生物和理化品質分析。

1.2.3 微生物分析 樣品中的各種微生物采用稀釋倒平板方式進行平板計數[5]。其中：菌落總數的計數采用PCA瓊脂，在37 ℃生化培養箱中培養2～3 d后分析其菌落總數；酵母和霉菌的計數采用孟加拉紅瓊脂，在30 ℃的生化培養箱中培養2～3 d后分析其菌落總數；乳酸菌的計數采用MRS瓊脂，在30 ℃的厭氧培養箱中培養2～3 d后分析其菌落總數。結果以每mL桑果汁中菌落數的常用對數值表示。

1.2.4 理化品質分析

（1）pH、總滴定酸和可溶性固形物。測定方法參考果汁行業標準SB/T 10203-1994進行測定。pH采用德國Sartorius PB-10型pH計測定；總酸采用直接滴定法，總酸度以檸檬酸計；可溶性固形物采用英國Stanley公司的阿貝折光儀直接測定（0Brix）。

（2）色差分析。采用UltraScan VIS型全自動色差儀（反射模式）對桑果汁樣品的色澤進行測定，以未處理的桑果汁（新鮮桑果汁）為色差測定參比樣，色差結果以L*、a*、b*和△E*表示[8]。

（3）抗壞血酸和花色苷含量的HPLC分析。抗壞血酸和花色苷含量的HPLC分析方法參照相關文獻[9-10]。在測定抗壞血酸時，桑果汁樣品與等體積的0.6%偏磷酸混合，離心去除沉淀，濾液過0.22 μm濾膜后直接上機分析。抗壞血酸的分離采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫25 ℃，流動相為0.1%（NH4）2HPO4，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL，采用UV-可見光檢測器檢測，其檢測波長為254 nm。在測定花色苷時，桑果汁樣品與等體積的酸性甲醇（含1%鹽酸）混合，離心去除沉淀，濾液經流動相稀釋后過0.22 μm濾膜待上機分析。花色苷的分離采用Waters XBridgeTM C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃，采用1.0 mL/min的流速進行梯度洗脫（溶劑A：10%甲酸水溶液；溶劑B：乙腈），梯度洗脫的程序：0～7 min， 溶劑B從6%升至9%；7～18 min，溶劑B從9%升至11%；18～30 min，溶劑B從11%升至30%；30～34 min，溶劑B從30%降至6%；6%的溶劑B后運行5 min。進樣量為10 μL，采用UV-可見光檢測器檢測，其檢測波長為560 nm。

（4）總酚含量測定。采用福林酚法測定[11]。

（5）抗氧化性測定。桑果汁的抗氧化性采用DPPH 清除力表示。DPPH清除力的測定參照相關文獻[11]，略加改進。以95%乙醇為溶劑，配制成濃度為130 μmol/L的DPPH溶液；移取20 μL待測的桑果汁樣品于10 mL試管中，補加蒸餾水至1 mL，加入5 mL DPPH溶液（130 μmol/L），使總體積為6 mL，搖勻；室溫放置30 min后倒入比色皿，記錄517 nm吸光度為A樣品（用5 mL 95%乙醇與1 mL樣品溶液調零，以扣除試樣本身顏色的影響）；向5 mL DPPH液中加入1 mL蒸餾水，記錄吸光度為A空白。結果以樣品的DPPH自由基清除率（%）表示。

DPPH自由基清除率=（A空白-A樣品）/A空白×100%。

（6）α-葡萄糖苷酶抑制率。α-葡萄糖苷酶抑制率測定方法參照董華強等[12]的方法，略加改進。取50 μL適宜稀釋度的桑果汁于96孔無菌細胞板中，加入100 μL 1 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液（pH6.9，

0.1 mmol/L磷酸緩沖液配制），反應10 min（25 ℃）后，繼續添加50 μL的5 mmol/L硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pH6.9，0.1 mmol/L磷酸緩沖液配制），混合均勻后，立即用酶標儀測定405 nm下的吸光度，以50 μL的0.1 mmol/L磷酸緩沖液（pH6.9）作空白對照。

α-葡萄糖苷酶抑制率=（1-A樣品/A空白）×100%。

1.3 數據分析

采用Microcal Origin 7.5（美國Microcal公司）軟件制圖，并用SPSS11.5軟件對數據進行方差分析（ANOVA）。每項指標重復3次，數值以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 添加DMDC對桑果汁微生物的影響

新鮮桑果汁的初始菌落總數和酵母菌數已經高達6個對數以上（圖1），未添加DMDC的新鮮桑果汁（對照組）在4 ℃低溫貯藏期間，酵母菌群快速生長，2～3 d后就有明顯的酒味，失去進一步加工的意義。桑果汁添加250 mg/L DMDC后在4 ℃貯藏期間菌落總數、乳酸菌數、酵母菌數、霉菌數的變化情況見圖1。由圖1可知，新鮮的桑果汁中添加250 mg/L DMDC后，菌落總數、乳酸菌數、酵母菌數以及霉菌數均呈線性快速下降，特別是酵母菌。添加DMDC 12 h后，酵母菌已經被完全殺滅，菌落總數、乳酸菌數和霉菌數分別下降至3.77、3.63和2.72 Lg（CFU/mL），但是隨著時間的進一步延長，果汁中各種污染菌的數量并沒有進一步下降。有研究表明，DMDC對微生物的致死作用跟菌體內關鍵酶蛋白被DMDC修飾失活密切相關。DMDC添加到果汁中后，除了與污染菌反應外，其自身還能發生水解，DMDC在4 ℃果汁中其半衰期只有6～8 h，DMDC分解后就不具有殺菌或抑菌作用[4-5]。添加250 mg/L DMDC的桑果汁在其后2個月的4℃低溫貯藏期間，并沒有發現殘留的酵母菌、菌落總數和乳酸菌數出現明顯的增加。但殘留的霉菌則表現出緩慢增長趨勢，且在貯藏30 d后已達到桑果汁初始霉菌數，由于殘留霉菌的進一步生長，貯藏30～40 d后果汁中出現肉眼可見絮狀的霉菌絲，為避免霉菌生長對后續桑果汁加工品質的影響，添加DMDC的桑果汁在低溫下貯藏時間建議不超過30 d。

2.2 添加DMDC對桑果汁品質的影響

桑果汁（4 ℃）中添加250 mg/L DMDC 12 h后，果汁中主要營養品質的變化。與對照組相比，添加250 mg/L DMDC 12 h后，桑果汁的pH、總滴定酸、可溶性固形物含量、總酚含量、α-葡萄糖苷酶抑制活力和總抗氧化活力（DPPH清除力）沒有發生顯著變化（p>0.05）（表1）。桑果汁中主要含有2種花色苷（蕓香苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷），但是添加250 mg/L DMDC 12 h后，2種花色苷的含量均下降30%以上，而未添加DMDC的對照組在4 ℃貯藏12 h后2種花色苷的含量變化不顯著。另外，添加250 mg/L DMDC 12 h后，桑果汁的L*（亮度），a*（紅綠）和b*（黃藍）值有輕微的下降，△E*的值為1.84，這可能跟添加DMDC后桑果汁中花色苷含量下降有關。花色苷是由花青素配基（苷元）與糖通過糖苷鍵結合而成的一類多酚類化合物，是桑果汁存在的主要天然色素。天然花青素配基的基本結構為3，5，7-三羥基-2-苯基苯并吡喃，桑果汁中添加DMDC后其花色苷含量下降可能與DMDC能與花色苷中的活性基團發生化學反應有關[4]。另外，本研究中桑果汁中VC的含量低于檢測限，這可能與桑果的成熟度和環境因素有關。一些研究結果表明，桑果在生長期間，隨著成熟度的提高，VC含量會快速下降[13]；桑果在榨汁期間，桑果中存在的VC氧化酶也能導致VC的氧化[13]。

前面的研究表明，向桑果汁中添加250 mg/L DMDC后能有效殺滅新鮮桑果汁中的污染微生物，能將桑果汁在低溫貯藏的時間延長至30 d。在30 d的貯藏期內（4 ℃），添加250 mg/L DMDC桑果汁的L*（亮度），a*（紅綠）、b*（黃藍）值、pH、總滴定酸和可溶性固形物含量沒有發生顯著變化（p>0.05），而總酚含量呈現明顯的下降趨勢（圖2），這可能跟低溫貯藏期間酚類物質的氧化和降解有關[14]；矢車菊素和蕓香苷的含量均呈現先上升后降低的趨勢（圖2），這可能是由于花色苷的DMDC修飾物不穩定，能自發水解生成花色苷；α-葡萄糖苷酶抑制活力和總抗氧化活力（DPPH清除力）也均呈現明顯的波動（圖3），但α-葡萄糖苷酶抑制活力總體沒有發生顯著變化，而總抗氧化活力（DPPH清除力）則下降了10.1%（圖3）。

3 討論與結論

向桑果汁中添加250 mg/L DMDC能有效的降低果汁中污染微生物菌群的數量，抑制桑果汁的腐敗，能將桑果汁在低溫貯藏的時間延長至30 d，可以作為一種短期保藏桑果汁加工原料的方法，能有效緩解小型果汁加工企業在桑果集中成熟期間熱巴氏殺菌設備的生產壓力。本研究發現，添加DMDC的桑果汁在低溫貯藏期間主要是殘留的霉菌生長，因此，可以通過控制桑果汁的氧溶解量（比如將處理后桑果汁灌入密封的復合鋁塑袋中）來抑制霉菌的生長，進一步延長DMDC處理桑果汁的保藏期。

DMDC雖然具有很強的化學反應活性，但本研究發現，添加250 mg/L DMDC到桑果汁中后，僅僅桑果汁中的2種花色苷（蕓香苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷）含量降30%以上，而桑果汁的pH、總滴定酸、可溶性固形物含量、總酚含量、α-葡萄糖苷酶抑制活力和總抗氧化活力（DPPH清除力）沒有發生顯著變化（p>0.05），并且桑果汁的色澤（紫紅色）也沒有發生肉眼可見的減弱。在30 d的貯藏期內（4 ℃），添加250 mg/L DMDC桑果汁的L*（亮度），a*（紅綠）、b*（黃藍）值、pH、總滴定酸和可溶性固形物含量也沒有發生顯著變化（p>0.05），進一步說明添加250 mg/L DMDC的桑果汁在4 ℃貯藏30 d內其殘留的微生物生長非常緩慢，幾乎沒有消耗果汁中的營養物質。

α-葡萄糖苷酶抑制活力和抗氧化活性是評價桑果汁品質的2個重要指標。一些研究結果表明，桑果汁中的α-葡萄糖苷酶抑制活力和總抗氧化力跟桑果汁中的多酚類物質相關，并且多酚類物質的化學結構也對兩者的活力會有明顯影響[14-15]。本研究發現，4 ℃，30 d的貯藏期內，添加250 mg/L DMDC桑果汁的矢車菊素與蕓香苷含量、α-葡萄糖苷酶抑制活力和總抗氧化力（DPPH清除力）均呈現明顯的波動，這可能跟花色苷的DMDC修飾物不穩定，能自發水解生成花色苷有關，后續實驗還需對其進行深入研究。另外，多酚類物質在低溫貯藏期間降解也對α-葡萄糖苷酶抑制活力和抗氧化活性有明顯的影響[14]。

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