菠蘿蜜實時熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選

汪永保等

摘 要 為篩選菠蘿蜜實時熒光定量PCR研究用的內(nèi)參基因，以菠蘿蜜不同發(fā)育階段的果實、葉和花序為材料，分析GAPDH、18S rRNA、UBQ、ɑ-tubulin和β-tubulin 5個內(nèi)參基因的表達情況，并對其表達穩(wěn)定性進行分析。結果表明，在各組織不同發(fā)育階段中，5個內(nèi)參基因的表達豐度變化存在差異；geNorm、NormFinder和BestKeeper 3種方法得出的結論有所不同，經(jīng)RefFinder綜合評價后，果實中最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA；葉片中最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因是UBQ、GAPDH、β-tubulin；花序中最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因是UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin。

關鍵詞 菠蘿蜜；實時定量PCR；內(nèi)參基因；表達穩(wěn)定性

中圖分類號 S431.191 文獻標識碼 A

Abstract To select appropriate reference genes for real time fluorescence quantitative experiment in jackfruit， samples of different developmental stages from the fruit， leaf and inflorescence were used to investigate the expression abundance and its expression stability of five reference genes， e.g.， GAPDH， 18S rRNA， UBQ， ɑ-tubulin and β-tubulin. Results showed that， at different developmental stages of jackfruit tissues， differences existed in the expression abundance of these five reference genes； Different conclusion in the stability of gene expression were obtained using geNorm， NormFinder and BestKeeper， and the comprehensive ranking by RefFinder indicated that， the three most stable reference genes in fruit were UBQ， GAPDH， 18S rRNA， while the three most stable reference genes were UBQ， GAPDH and β-tubulin in leaf and UBQ， GAPDH and ɑ-tubulin in inflorescence.

Key words Jackfruit（Artocarpus heterophyllus Lam.）；Real time quantitative PCR；Reference gene；Expression stability

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.021

實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）是一種利用在PCR反應體系中添加特定熒光基團，對整個PCR反應過程中的產(chǎn)物變化進行實時監(jiān)測，從而對核酸樣品或者目標基因的表達進行定性或者定量分析的方法[1]，具有重復性好、靈敏度高、定量準確、速度快等優(yōu)點，已廣泛用于農(nóng)業(yè)及醫(yī)學等生命科學領域。由于RT-qPCR的結果會受到各種因素的影響，如RNA提取、逆轉錄、cDNA合成及PCR擴增效率等，容易導致分析結果與目標基因真實表達值間存在差異[2]；在實際應用中，為獲得真實可靠的實驗結果，常利用表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因進行校正和標準化[3]，以減少樣品之間和樣品內(nèi)部的誤差。

理想的內(nèi)參基因應是在各種實驗環(huán)境和影響因子下、在不同的組織和細胞中都能恒定或相對穩(wěn)定地表達。然而，近年來的研究表明，并沒有絕對穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，任何一種管家基因都只能在特定的環(huán)境或一定類型的組織和細胞中恒定表達[4]。隨著定量要求的不斷提高，為了得到更真實可靠的實驗結果，研究人員趨向于使用多個內(nèi)參基因的幾何平均值用于靶基因的標準化校正[5]。因而，選擇哪些基因以及選擇多少基因用作內(nèi)參基因，已成為實時定量PCR實驗中需要著重考慮的關鍵性問題。

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）是桑科（Moraceae）木菠蘿屬（Artocarpus）植物，又稱木菠蘿、樹菠蘿，其果大肉甜，香氣濃郁，是中國熱帶、南亞熱帶重要的優(yōu)稀水果，在廣東、海南、廣西和云南等地均有分布和栽培[6]。隨著國內(nèi)外對菠蘿蜜研究的不斷深入，基因表達分析逐漸成為一項重要的實驗內(nèi)容。內(nèi)參基因在基因表達分析中起著至關重要的作用，然而到目前為止，國內(nèi)外還未見有關菠蘿蜜內(nèi)參基因選擇和利用的報道。本研究利用RT-qPCR技術，并借助多種分析工具，分析5個內(nèi)參基因在不同菠蘿蜜組織樣品中的表達穩(wěn)定性，旨在研究此5個內(nèi)參基因在菠蘿蜜果實、葉和花組織中的表達特點，建立內(nèi)參基因的選擇方法，篩選出適宜的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

菠蘿蜜：以廣東海洋大學農(nóng)學院種質圃內(nèi)的GHsj13hh01菠蘿蜜種質為材料，取不同發(fā)育階段的果實（幼果、小果、大果、七成熟果、成熟果）、葉片（成熟葉、幼葉）和雌花序（未開放、盛花）、雄花序（未開放、盛花）等11種材料，每種材料各取8份，液氮下研磨成粉末，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

儀器和試劑：實時熒光定量PCR儀為LightCyclerR2.0 PCR儀（Roche公司），使用Roche原裝的PCR毛細管。T/A克隆試劑盒pMDTM19-T、RNA提取試劑盒RNAiso-mate for Plant Tissue和RNAiso Plus、cDNA第一鏈合成試劑盒PrimeScriptRRT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）以及熒光定量PCR試劑盒SYBRRPremix Ex TapTM（Tli RNase H Plus）購自寶生物工程（大連）有限公司。PCR產(chǎn)物回收試劑盒E.Z.N.A.RGel Extraction Kit購自OMEGA公司。各內(nèi)參基因的擴增引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 按照RNA提取試劑盒的說明書提取樣品的總RNA，用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度和質量。

1.2.2 cDNA第一鏈的合成 取1 μg總RNA，參照試劑盒說明合成cDNA第一鏈，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR引物設計和驗證 利用Primer Premier 6.0軟件，根據(jù)同源基因的保守區(qū)域分別設計GAPDH、18S rRNA、UBQ、α-tubulin和β-tubulin 5個內(nèi)參基因的熒光定量用PCR引物。用常規(guī)PCR對上述5個基因進行擴增：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對其進行回收、純化，與pMDTM19-T載體連接后轉化大腸桿菌（DH5α），經(jīng)藍白斑篩選陽性克隆后送上海生工測序。

1.2.4 內(nèi)參基因的RT-qPCR分析 參照SYBRRPremix Ex TapTM（Tli RNase H Plus）試劑盒說明書進行內(nèi)參基因的RT-qPCR分析。反應體系為SYBRRPremix Ex TapTM（2×）10.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA第一鏈（稀釋10倍）2.0 μL，dd H2O補足到20 μL，每樣品重復3次。PCR擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。熔解曲線分析：95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s（20 ℃/s），95 ℃ 0 s（0.1 ℃/s）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用geNorm[4]、NormFinder[7]和BestKeeper[2]對5個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行統(tǒng)計學分析，最后再使用基于web的分析工具RefFinder[8]對各內(nèi)參基因進行了綜合評價。在使用geNorm和NormFinder分析前，用比較Ct法轉換原始數(shù)據(jù)，即設定樣本中Ct值（循環(huán)閥值，Cycle threshold）最小者的表達量為1，根據(jù)2-△Ct法計算其他樣本的相對表達量，其中△Ct=各樣本Ct值-最小Ct值。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取

提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測后，菠蘿蜜各樣品總RNA電泳圖譜帶型清晰，28S rRNA的亮度約是18S rRNA亮度的1.5～2.0倍，表明RNA樣品無明顯降解，完整性較好，可用于后續(xù)試驗。

2.2 內(nèi)參基因引物的擴增產(chǎn)物分析

以RNA經(jīng)反轉錄合成的cDNA為模板，所設計的各內(nèi)參基因引物均能擴增出特異的條帶（圖1）。擴增片段經(jīng)回收測序后，大小在80～115 bp之間（表1）。序列經(jīng)Blast分析后表明，各引物擴增出的片段均為目標基因片段。

2.3 內(nèi)參基因熒光定量PCR分析

以菠蘿蜜不同組織的cDNA第一鏈為模板，進行實時熒光定量PCR分析（圖2）。從圖2可以看出，5對內(nèi)參基因引物在各個材料中的擴增產(chǎn)物的熔解曲線都只有單一峰，說明其擴增是特異性的，不存在引物二聚體。各樣品重復擴增間的差異很小，重復孔間的Ct值差異<0.5，說明所使用的實時熒光定量PCR方法重復性高，結果準確可信。

基因的表達豐度越高，其Ct值越小，反之，Ct值越大。5個內(nèi)參基因在所研菠蘿蜜材料中的表達豐度存在差異（圖3）。18S rRNA的表達豐度最高，Ct值為13.73～17.48，平均為15.81；GAPDH的表達豐度最低，Ct值為24.62～29.46，平均為27.00；其余3個內(nèi)參基因的表達豐度較為接近，平均值為21.42～24.04。

在菠蘿蜜不同組織以及同一組織不同發(fā)育階段的材料中，5個內(nèi)參基因的Ct值也存在差異。ɑ-tubulin和β-tubulin 2個基因的Ct值變化較大，在果實中，均隨著果實的發(fā)育和成熟，Ct值增加；在成熟葉和嫩葉中也存在較大變化，嫩葉中的Ct值低于老葉；在花序組織中的差異較小，其中，β-tubulin基本無變化，ɑ-tubulin的Ct值在未開放花序中略低。18S rRNA在七成熟果及未開放雌、雄花序中的有較小的Ct值，在其他材料中的Ct值較為接近。UBQ基因在果實中的Ct值沒有太大變化，成熟葉中的Ct值要大于老葉，盛開花序中的Ct值大于未開放的花序。除七成熟果中的Ct值較低外，GAPDH在果實和葉片中的Ct值較為接近，開放花序中的Ct值要高于未開放花序中的Ct值。

2.4 內(nèi)參基因的選擇

2.4.1 GeNorm分析 經(jīng)GeNorm方法分析后，獲得的各內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性見表2。從表2可以看出，在菠蘿蜜的不同組織中，內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性存在差異。把所有的組織材料用于分析時，GAPDH和18S rRNA基因的表達最為穩(wěn)定，其次是UBQ，ɑ-tubulin和β-tubulin；在果實中，GAPDH和18S rRNA的表達最為穩(wěn)定，其次是UBQ，ɑ-tubulin和β-tubulin；在葉片中，ɑ-tubulin和β-tubulin的表達最穩(wěn)定，其次是UBQ，GAPDH和18S rRNA；在花序中，GAPDH和UBQ的表達最穩(wěn)定，其次是ɑ-tubulin，18S rRNA和β-tubulin。

經(jīng)GeNorm方法分析后，不同菠蘿蜜組織中，分別使用3、4、5個內(nèi)參基因來計算歸一因子（Normalization factor，NF）后，得出的歸一因子間的差異情況見圖4。從圖4可看出，除葉組織外，各樣品集中，隨著歸一因子計算用內(nèi)參基因數(shù)的增加，得出的歸一因子之間的差異也在不斷增加，果實組織中的增加最為明顯。在葉組織中，用5個內(nèi)參基因計算出的歸一因子與用4個內(nèi)參基因計算出的歸一因子間的差異表現(xiàn)出下降的趨勢，但遠未達到該方法所推薦的0.15的水平。

由于歸一因子的配對差異分析無法得出最優(yōu)的內(nèi)參基因數(shù)，可采取直接選擇3個最穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因用于計算歸一因子。說明選擇適用于所有組織的內(nèi)參基因是不切實際的。因此，在菠蘿蜜果實中，可使用GAPDH、18S rRNA和UBQ基因作為共同內(nèi)參；葉片中，可使用ɑ-tubulin、β-tubulin和UBQ基因作為共同內(nèi)參；花序中，可使用GAPDH、UBQ和ɑ-tubulin基因作為共同內(nèi)參。

2.4.2 NormFinder分析 NormFinder方法的分析結果見表3。基因表達的穩(wěn)定性用穩(wěn)定值來表示，穩(wěn)定值越小，基因的表達就越穩(wěn)定。把所有的組織材料用于分析時，表達穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因是UBQ（0.466），表達穩(wěn)定性最低的是β-tubulin（1.111）基因；最宜用作內(nèi)參的基因是UBQ，最佳的2個基因組合是18S rRNA和ɑ-tubulin，組合后的穩(wěn)定值為0.399。在果實中，UBQ（0.372）是表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，β-tubulin基因的表達穩(wěn)定性最低（1.540）；最宜用作內(nèi)參的基因是UBQ，而最佳的2個基因組合是GAPDH和ɑ-tubulin，組合后的穩(wěn)定值為0.323。在葉片中，UBQ（0.156）是表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，18S rRNA基因的表達穩(wěn)定性最低（1.240）；最宜用作內(nèi)參的基因是UBQ，而最佳的2個基因組合是GAPDH和ɑ-tubulin，組合后的穩(wěn)定值為0.164。在花序中，GAPDH（0.304）是表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，β-tubulin基因的表達穩(wěn)定性最低（0.818）；最宜用作內(nèi)參的基因是GAPDH，而最佳的2個基因組合是GAPDH和ɑ-tubulin，組合后的穩(wěn)定值為0.239。

2.4.3 BestKeeper 分析 BestKeeper方法的分析結果見表4和表5。當把所有的材料作為一個樣品集時，5個內(nèi)參基因Ct值的標準差均>1；按照BestKeeper的選擇標準，這些內(nèi)參基因的表達都是不穩(wěn)定的，因而都不宜用于計算BestKeeper index。

在果實中，β-tubulin和ɑ-tubulin 2個內(nèi)參基因Ct值的標準差>1（見表4）；相關分析結果也表明，GAPDH與β-tubulin和ɑ-tubulin、18S rRNA與β-tubulin和ɑ-tubulin間的相關關系均未達到顯著水平。將這2個內(nèi)參基因剔除后，計算出的BestKeeper index值與3個內(nèi)參基因之間的相關性均達到極顯著水平，相關系數(shù)為0.709～0.982（見表5）。因而適宜的內(nèi)參基因是GAPDH、UBQ和18S rRNA。

在葉片中，UBQ、β-tubulin和ɑ-tubulin 3個內(nèi)參基因Ct值的標準差均大于1（見表4），但僅GAPDH與18S rRNA間的相關性不顯著，其他內(nèi)參基因之間的相關性均達到顯著或極顯著水平；將這3個基因剔除后，計算出的BestKeeper index值與2個內(nèi)參基因之間的相關性均達到顯著或極顯著水平，相關系數(shù)為0.856～0.959（見表5）。因而，適宜的內(nèi)參基因為GAPDH與18S rRNA。

在花序中，GAPDH、UBQ和18S rRNA 3個內(nèi)參基因Ct值的標準差均>1（見表4），但僅18S rRNA和ɑ-tubulin間的相關性未達到顯著水平，其他內(nèi)參基因之間的相關性均達到顯著或極顯著水平；將這3個基因剔除后，計算出來的BestKeeper index值與這2個內(nèi)參基因之間的相關性較低，僅ɑ-tubulin與BestKeeper index值的相關性達到極顯著水平。然而，當把β-tubulin和ɑ-tubulin 2個基因剔除后，計算出來的BestKeeper index值與3個內(nèi)參基因之間的相關性均達到極顯著水平，相關系數(shù)為0.937～0.968（見表5）。因此適宜的內(nèi)參基因為GAPDH、UBQ和18S rRNA。

2.4.4 RefFinder 分析 RefFinder的分析結果見表6。基因表達的穩(wěn)定性越小，其表達就越穩(wěn)定。當把所有的材料作為一個樣品集時，最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA；在果實中，最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA；葉片中，最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因是UBQ、GAPDH、β-tubulin；花序中最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因是UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin。

3 討論與結論

在qRT-PCR分析中，穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因是基因表達分析的重要前提[9]。不同物種或同一物種的不同組織，適用的內(nèi)參基因可能存在差異，如楊樹根發(fā)育的不同時期中Eflɑ和18Sr RNA表達穩(wěn)定[10]，不同柑橘品種中則是ACTB，18Sr RNA和rpII表達穩(wěn)定[11]，UBQ在蘋果[12]和白樺[13]中表達穩(wěn)定，茶樹[5]不同組織和不同成熟度的葉片中穩(wěn)定表達的分別是β-actin和GAPDH；琯溪蜜柚果實發(fā)育不同時期和不同組織中表達較為穩(wěn)定的是β-tubulin，而actin1和EF1-a則分別適用于琯溪蜜柚果實發(fā)育不同時期和不同組織[14]。除了傳統(tǒng)的看家基因外，一些穩(wěn)定表達的基因也可用作內(nèi)參基因[15]。

一些經(jīng)典的內(nèi)參基因在不同的實驗條件下，其表達水平會發(fā)生變化[16]。本研究結果表明，5個基因（GAPDH、18SrRNA、UBQ、ɑ-tubulin和β-tubulin）的表達水平在所研材料間存在明顯差異，變化趨勢也不相同；GeNorm分析結果表明，全部材料、果實、葉片和花序中最穩(wěn)定的2個基因分別是GAPDH-18S rRNA、GAPDH-18S rRNA、ɑ-tubulin-β-tubulin和GAPDH-UBQ，但未能根據(jù)0.15的推薦值得出最佳的基因數(shù)。NormFinder分析結果表明，全部材料、果實、葉片和花序中最穩(wěn)定的2個基因分別是18S rRNA-ɑ-tubulin、GAPDH-ɑ-tubulin、GAPDH-ɑ-tubulin和GAPDH-ɑ-tubulin。BestKeeper分析結果表明，果實、葉片和花序中最穩(wěn)定的基因分別為GAPDH-UBQ-18S rRNA、GAPDH-18S rRNA、GAPDH-UBQ-18S rRNA。因此，在所有的菠蘿蜜組織中使用同樣的內(nèi)參基因是不適宜的，而且不同分析方法得出的結論也存在差異。

雖然有研究表明不同分析方法可以得出相同的結果[5，17]，但也有例外[7，18-19]，主要是由于不同分析方法判斷基因表達穩(wěn)定性的依據(jù)不同[2，4，7]。考慮到不同分析方法所得結果的差異，RefFinder[8]將4種分析方法（geNorm，Normfinder，BestKeeper和比較△Ct法）的排序結果賦予相應的權重后，得出一個基于幾何平均值的綜合排序結果，并被證明是可行的[20-21]。對于內(nèi)參基因的數(shù)量，Vandesompele[4]建議可不理會軟件對最適內(nèi)參基因數(shù)的分析結果，直接選擇最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因。Fu等[22]也建議使用3個最穩(wěn)定的基因用作內(nèi)參基因。根據(jù)上述方法，本研究建議在菠蘿蜜的果實中使用UBQ、GAPDH、18S rRNA作為內(nèi)參基因，在葉片中使用UBQ、GAPDH、β-tubulin作為內(nèi)參基因，在花序中使用UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin作為內(nèi)參基因。但隨著菠蘿蜜基因發(fā)掘和表達研究的深入，不排除會出現(xiàn)更穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

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