辣椒SRAP—PCR反應體系優化及雜交群體多態性引物篩選

張佳琦　呂慶芳　董黎梨　李映志　葉春海

摘要[目的]對辣椒SRAP反應體系進行研究和優化，并利用優化體系對164對多態性引物進行篩選。[方法]采用單因素隨機試驗設計和L25（65）正交試驗設計對辣椒SRAP反應體系中6種關鍵因素（退火溫度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA）進行體系優化，并以“泡椒”ד青皮大椒”的親本和F1代為材料，利用聚丙烯胺酰胺凝膠進行篩選。[結果]辣椒SRAPPCR的最佳反應體系為：退火溫度35.5 ℃，Taq DNA聚合酶1.0 U，模板DNA 2.25 ng/μl，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.4 μmoL/L，Mg2+ 2 mmol/L，總體積為20 μl。利用該體系，從164對SRAP引物組合中篩選出擴增條帶清晰、多態性豐富、條帶穩定的31對引物組合。[結論]該體系的建立與多態性引物組合的篩選為SRAP標記技術在辣椒育種中的應用奠定了基礎。

關鍵詞辣椒（Capsicum spp.）；正交試驗設計；單因素隨機試驗設計；SRAP；PCR

中圖分類號S641.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）07-01913-04

辣椒（Capsicum spp.）是一種世界性的蔬菜作物，即可鮮食又可用作辣椒油、辣椒紅素和辣椒素的提煉[1]，同時含有豐富的VC和礦質元素[2]，是我國人民飲食結構的重要組成部分。隨著SSR（Simple sequence repeat，簡單序列重復）、RAPD（Random Amplified polymorphism DNA，隨機擴增多態性DNA）、ISSR（Inter-simple sequence repeat，簡單序列重復區間擴增多態性）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片斷長度多態性）和SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism，相關序列多態性）等DNA分子標記技術的發展，其在辣椒育種中的運用日益增多[3-10]。

SRAP標記是Li和Quiros開發的一種基于PCR （ polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應）的新型分子標記技術[11]。該標記通過獨特的引物設計可對開放閱讀框 （open reading frames，ORFs）進行擴增，因個體間內含子、啟動子與間隔區長度不等而產生多態性。由于其具有多態性豐富、成本低廉、操作簡便、穩定性好和高度共顯性等特點[12]，被廣泛用于遺傳多樣性評價[13]、種質材料鑒定[14]和遺傳圖譜構建[15-18]等最早開展SRAPPCR反應體系的優化研究。隨后，這一分子標記技術被用于辣椒的種子純度檢測[20-21]、遺傳多樣性分析[22-24]、辣椒雜種優勢的預測[25]和自交系遺傳關系評價[26]等方面。

由于SRAP分子標記直接擴增開放閱讀框，提高了擴增結果與表型性狀的相關性，可將分子標記與基因克隆直接結合起來[27]，因此而成為遺傳圖譜構建的重要分子標記之一[28-31]，但在辣椒遺傳圖譜構建中的應用還比較少。鑒于此，筆者構建 “泡椒”ד青皮大椒”的分離群體，通過SRAPPCR擴增體系優化，利用親本和F1代材料篩選擴增多態性豐富且條帶穩定的引物組合，以期為辣椒遺傳圖譜的構建奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料 以2013年3月種于廣東雷州的青皮大椒、泡椒及其F1代植株為試驗試材。Taq DNA聚合酶和dNTPs，均購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；1 000 bp DNA Marker，購自購自寶生物工程（大連）有限公司；SRAP引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；PCR儀，購自Biometra；凝膠電泳設備，購自北京鴻濤基業科技發展有限責任公司。

1.2基因組DNA的提取與檢測 采用改良CTAB法[32]提取青皮大椒的總DNA，并采用紫外分光光度計法檢測其濃度，于-20 ℃保存備用。

1.3SRAPPCR單因素隨機試驗 以青皮大椒總DNA為材料，以含Taq DNA聚合酶1 U、Mg2+ 2 mmol/L、模板2.5 ng/μl、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.4 μmol/L的20 μl反應體系為基礎，分別改變退火溫度（33、34、35、36和37 ℃）、Taq DNA聚合酶量（0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 U）、模板濃度（0.5、1、2、2.5和5 ng/μl）、dNTPs濃度（0.05、0.10、0.20、0.25和0.50 mmol/L）、引物濃度（0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 μmol/L）和Mg2+濃度（1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mmol/L），以EM6為正向引物、ME18為反向引物，進行5水平單因素隨機試驗，3次重復。

1.4擴增程序 參考Li和Quiros的方法：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，35 ℃，1 min，72 ℃，1 min，5個循環；隨后將退火溫度升至50 ℃，其他條件不變，進行35個循環；最后以72 ℃延伸10 min。擴增產物經6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，銀染檢測[11]。

1.5SRAPPCR正交試驗 以青皮大椒總DNA為模板，采用L25（65）正交試驗設計（表1）。SRAP正向引物為EM6，反向引物為ME18，總反應體系20 μl，基本擴增程序按“1.4”中方法；重復2次。從擴增條帶數、凝膠染色背景和帶的強弱等方面綜合評價擴增效果[33]，以條帶數為主，對所有結果按照效果好壞排序，取其排序的數字作為擴增效果的評價值，評價值越高，結果越好。